СРЕДСТВО LÖWENSTEIN-JENSEN: ОСНОВА, ПОДГОТОВКА И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЯ - 2025

Средата Löwenstein-Jensen е селективна твърда среда за изолиране и развитие на бактерии от рода Mycobacterium, като Mycobacterium tuberculosis, M. avium, между другото, с изключение на вида лепра, който не е култивиран.

Бактериите от рода Mycobacterium не растат в конвенционалните културни среди, поради което беше необходимо да се създаде специална среда за тяхното изолиране. Оригиналният носител е създаден от Льовенщайн и по-късно модифициран от Йенсен.

Среда Löwenstein-Jensen с колонии Mycobacterium tuberculosis. Източник: Agarwal et al / BioMed Central Ltd., с любезното съдействие на Библиотеката за изображения на биологията

Модификацията се състоеше в елиминирането на червеното багрило в Конго, заменяйки го с по-висока концентрация на малахитово зелено. Той също промени концентрациите на магнезиев цитрат и монокалиев фосфат.

Понастоящем средата на Löwenstein-Jensen съдържа картофено нишесте, аспарагин, магнезиев цитрат, монокалиев фосфат, магнезиев сулфат, малахитово зелено, налидиксинова киселина, циклохексимид, линкомицин, яйца, глицерин и вода.

Микобактериите обикновено се изолират от места, които не са стерилни, като храчки, урина, абсцеси, между другото. Това означава, че повечето от пробите ще съдържат обичайната микробиота в района, плюс патогена.

Ето защо средата на Льовенщайн-Йенсен съдържа серия от инхибитори в състава си, представени от малахитово зелено, антибиотици и противогъбични лекарства.

В допълнение, пробите, които идват от нестерилни места, трябва да бъдат обеззаразени и неутрализирани, преди да бъдат засети в средата на Löwenstein-Jensen.

основа

Наличието на яйце и глицерин в средата на Льовенщайн-Йенсен стимулира растежа на микобактериите, тъй като те осигуряват необходимите за развитието на тези микроорганизми мастни киселини и протеини.

Средата Löwenstein-Jensen съдържа малахитово зелено, което е инхибитор на придружаващата микробиота. Но също така съдържа налидиксинова киселина (35 µg / mL), която инхибира грамо отрицателната микробиота, циклохексимид (400 µg / mL), който инхибира сапрофитните гъбички и дрожди, и линкомицин (2 µ / mL), който инхибира грам положителната микробиота.

Някои търговски къщи предпочитат да добавят следната комбинация от антибиотици: полимиксин В 200 000 единици / L, амфотерицин В 10 mg / L, карбеницилин 50 mg / L и триметоприм 10 mg / L.

Тази среда не съдържа агар, следователно втвърдяването на средата се дължи на коагулацията на албумина, присъстващ в яйцеклетката по време на стерилизация.

подготовка

Претеглят се 37,3 g от дехидратираната среда в 600 ml дестилирана вода, към която преди това са добавени 12 ml глицерол. Сместа се загрява, като се разбърква често до пълното й разтваряне. Автоклавирайте средата при 121 ° С за 15 минути.

От друга страна, при асептични условия трябва да се приготви хомогенна суспензия от 1000 ml свежи яйца. Добавете яйчената суспензия към 600 ml среда, приготвена при температура 50 - 60 ° C, като избягвате въздушните мехурчета.

Антибиотични разтвори се добавят и след стерилизация в автоклава.

Изсипете средата в стерилни епруветки с винтове. Загрейте епруветките при 85 ° С за 45 минути в наклонено положение.

Цветът на приготвената среда е аквамарин зелен и може да има белезникави петна поради наличието на яйчни липиди.

PH на средата трябва да бъде 7,2 ± 0,2

Съхранявайте епруветките в хладилник и защитени от пряка светлина до употреба. Темпер преди сеитбата.

Има модификация на носителя, наречен „Груфт модификация на Löwenstein Jensen“. Това съдържа същите съединения като класическата среда, но се добавя RNA-5mg / 100 mL и като инхибитори съдържа малахитово зелено 0,025 g / 100 mL, пеницилин 50 U / mL и налидиксинова киселина 35 ug / mL.

Приложения

Средата Löwenstein-Jensen се използва за изолиране на микобактерии от различни видове проби. Петна от Ziehl-Neelsen се препоръчва за всеки проба, в която се подозира наличието на микобактерии.

Някои проби идват от стерилни места, но други не. Нестерилните проби трябва да бъдат обеззаразени, както е подходящо:

храчка

Пробите от храчки трябва да бъдат обеззаразени, както следва: определете количеството на пробата от храчки в ml и добавете същото количество от 4% NaOH към пробата и инкубирайте при 37 ° C.

Разклащайте сместа често в рамките на 30 минути. Впоследствие се центрофугира при 3000 RPM за 30 минути.

Изхвърлете супернатантата върху фенолен дезинфектант. Използвайте утайката за сеитба, но първо pH трябва да се неутрализира.

За неутрализиране на утайката, 5% H ₂ SO ₄ се използва в присъствието на червено показател на фенол, докато достигне неутрално рН, което причинява цвят на сьомга.

Стомашна промивка, промиване на бронхи и бронхиален аспират

В този случай пробата трябва да се центрофугира при 3000 RPM за 30 минути. Супернатантът се изхвърля и пелетът се използва. За обеззаразяване на утайката се добавя 3 ml 4% NaOH и се разбърква често при 37 ° С за период от половин час.

Центрофуга отново, супернатантата се изхвърля и пелетът се използва. Последните трябва да бъдат неутрализирани, както е обяснено в пробата за храчки.

урина

Оставете пробата да се утаи в хладилника за 24 часа. Отделете супернатантата. Останалите пелети трябва да се центрофугират за 30 минути при 3000 RMP. Изхвърлете супернатантата отново и разтворете пелетата с 3 ml стерилен физиологичен разтвор.

Добавете 3 ml 4% NaOH и продължете към дезактивация и неутрализация, както е описано по-горе.

Асцитна течност, плеврална течност, цереброспинална течност

В този тип проба се центрофугира и супернатантата се изхвърля. Извършете грам върху утайката или наблюдавайте директно под микроскоп; Ако не се наблюдават бактерии, етапът на дезактивация не е необходим, нито е етапът на неутрализация.

В този случай пробата може да бъде засята директно с помощта на утайката. Ако има бактерии, пристъпете към обеззаразяване и неутрализиране, както е описано по-горе.

Биопсията

Към този тип проба трябва да се добавят 5 ml дестилирана вода за по-късна центрофуга при 1500 RPM за 10 минути. Изхвърлете супернатантата и центрофугирайте пелетата при 3500 RPM за 30 минути. Използвайте утайката, за да посеете хранителната среда.

Ларингеален тампон

Тампонът трябва да се постави в стерилна епруветка, съдържаща равни части дестилирана вода и 4% NaOH. Тампонът трябва да се притисне към стените на епруветката, така че пробата да се разрежда в течността. Центрофугирайте и използвайте утайката. Неутрализирайте утайката, както вече беше описано.

засети

Средата Löwenstein-Jensen се инокулира чрез добавяне на 0,5 ml от пробата върху повърхността на средата. Завъртете епруветката, за да разпределите пробата в средата. Не използвайте платинена дръжка.

Втора тръба, съдържаща среда на Stonebrink, може да бъде засята, за да се изолират Mycobacterium bovis и други видове, които не растат върху среда на Löwenstein-Jensen.

инкубация

Инокулираните епруветки се инкубират аеробно при 37 ° С, като капачката е леко разхлабена и наклонена на приблизително 5 ° и е защитена от светлина. Средата може да бъде обогатена с 5-10% въглероден диоксид. Проверявайте културите два пъти седмично, докато се появят колонии.

Когато пробата се абсорбира, капачките се затягат. Максималното време на инкубация е 8 седмици, ако след това време няма растеж, се отчита като отрицателно.

QA

Следните щамове могат да бъдат използвани за контрол на качеството:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogec ATCC6 19 AT4, ATCC6 19 ATC, 19 ATC, 19 ATC, ATCC6, ATCC6 19 ATC

Очаква се отлично развитие за първите три споменати вида, за M. fortuitum растежът трябва да бъде добър, докато за M. bovis малък или никакъв растеж не се очаква. Междувременно видове, различни от рода Mycobacterium, трябва да бъдат напълно инхибирани.

Ограничения

Приготвената среда трябва да бъде защитена от светлина, продължителното излагане на светлина води до превръщането й от зелено в синьо, в този случай носителят вече не може да се използва. Това е така, защото малахитовото зелено е фоточувствително.

Средата, тъй като съдържа яйца, може лесно да се замърси, ако с нея не се работи асептично. Може да се разтвори, ако се замърси с протеолитични бактерии.

Отглеждането и боравенето с бактерии от рода Mycobacterium изисква квалифициран персонал, който е запознат с мерките за биологична сигурност, които трябва да се спазват, за да не се замърси или замърси други.

HCl не трябва да се използва в етапа на неутрализация поради образуването на натриев хлорид, който може да бъде токсичен за бацила на Кох.

Пробите трябва да се съхраняват в хладилник и да се пазят от светлина, докато не се обработват.

препратка

1. Франсиско Сория Мелгуизо Лаборатории. 2009. Селективен носител на Льовенщайн-Йенсен. Достъпно на: f-soria.es
2. Britannia Laboratories. 2017. Медиен Löwenstein-Jensen. Достъпно на: britanialab.com.
3. Неогенни лаборатории. Медиен Löwenstein-Jensen. Достъпно на: foodsafety.neogen.com.
4. „Средство Льовенщайн-Йенсен“. Уикипедия, Свободната енциклопедия. 20 ноември 2018 г., 15:15 UTC. 24 април 2019 г., 18:34 ч. wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологична диагноза. 5-то изд. Редакция Panamericana SA Аржентина.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Микробиологична диагностика на Бейли и Скот. 12 изд. Редакция Panamericana SA Аржентина.
7. Mac Faddin J. (2003). Биохимични тестове за идентифициране на бактерии с клинично значение. 3-то изд. Редакция Panamericana. Буенос Айрес. Аржентина.