ПРОТЕИНАЗА K: ХАРАКТЕРИСТИКИ, ЕНЗИМНА АКТИВНОСТ, ПРИЛОЖЕНИЯ - БИОЛОГИЯ - 2025

На протеиназа К е ензим, който принадлежи към групата на сериновите протеази, т.е., тя има в средната си каталитично активна аминокиселина серин и има функцията на разчупване на пептидните връзки чрез хидролиза. От своя страна този ензим принадлежи към семейството на субтилизиновите протеини (пептидаза S8).

Протеиназата К има молекулно тегло (MW) от 28 900 далтона и е изолирана за първи път през 1974 г. в екстракти от гъбичката Engyodontium album, известна по-рано като Tritirachium album Limber.

Молекулярна структура на протеиназа K. Източник: Lykchiniadis

Той има висок протеолитичен капацитет, демонстриран чрез способността да разгради кератина, присъстващ в косата. Думата кератин на английски се изписва „кератин“, оттук е наречена „протеиназа К“.

Поради високата си сила за разцепване на местните протеини, този ензим е полезен в различни техники за молекулярна биология. Използва се предимно за изолиране и приготвяне на нуклеинови киселини с високо молекулно тегло (MW).

Протеиназата К работи, като освобождава ядрена ДНК, като същевременно унищожава протеините и инактивира РНКазите и ДНКазите, тоест елиминира нуклеази в препаратите на ДНК и РНК.

От друга страна се вижда, че протеиназата К може да хидролизира някои денатурирани местни протеини, което предизвика интереса на изследователите за нейното използване при изследване на прионни протеини (PrPC).

Въпреки това, въпреки високата си протеолитична потентност, има протеини, които са устойчиви на действието на протеиназа К. Сред тях има някои анормални протеини, наречени приони (PrPSc), свързани с трансмисивни спонгиформни енцефалопатии.

Характеристики на протеиназа К

Протеиназата К има третична структура, изградена от три слоя, със седемверижен β лист, разположен между два слоя от спирали. Тъй като принадлежи към семейството на пептидазите S8, той се характеризира с наличието на каталитичен триад в активното му място, чийто последователен ред е (Asp, His и Ser), което ги разграничава от останалите семейства на пептидазите.

Този ензим от групата на серинови протеази се характеризира с хидролиза на пептидните връзки, близки до карбоксилната група на алифатни и ароматни аминокиселини.

От друга страна, той е в състояние да действа в присъствието на някои корозивни вещества, като натриев додецил сулфат (SDS), Tris-HCL и EDTA, които се използват за подпомагане на денатурацията на протеините, причинявайки им загуба на собствената си структура.

Това е предварителна стъпка в подготовката на протеини за електрофорезата. Диапазонът на pH, при който протеиназата К действа, е доста широк (2,0 до 12,0), с оптимално рН между 7,5 до 12,0, а нейната изоелектрична точка е 8,9. Както се вижда, той е активен срещу много широк диапазон на рН.

Друга характеристика, която се откроява при протеиназата К е нейната стабилност при наличието на високи температури (50 - 60 ° С).

Ензиматична активност

Протеиназата К изисква присъствието на калциевия йон, въпреки че това не влияе на неговата активност, ако е от съществено значение за поддържането на неговата стабилност.

За протеиназа К за пълно усвояване на субстрата е необходимо време за контакт от приблизително 5 минути до 2 часа.

В този смисъл обаче, Daza и др. Сравняват чистотата на ДНК, получена в различни периоди на експозиция срещу протеиназа К, и стигат до извода, че продължителната инкубация (до 24 часа) значително подобрява качеството на ДНК.

Но по отношение на концентрацията на ензима протеиназа К, използван в различните протоколи, може да се каже, че той е много разнообразен.

Може да се използва от много ниски концентрации (5 µg / ml) до концентрации от 500 µg / ml. Но най-често срещаните работни концентрации варират от 50-100 μg / ml, особено за храносмилането на протеини и нуклеазната инактивация. Въпреки че за лечение на тъкани е необходима концентрация от 2 mg / ml.

Приложения

Приложенията му са много широки и могат да бъдат обобщени, както следва:

-Използва се при храносмилането на протеини и извличането на ДНК чрез различни методи като: осоляване, PK-SDS, цетил-триметил амониев бромид (CTAB), модифициран калиев ацетат и екстракция с натриев йодид.

-Инактивиране на нуклеази (RNases и DNases).

-В техниката на хибридизация in situ (HIS), за да се подпомогне освобождаването на нуклеинова киселина, в допълнение към елиминирането на нежеланите протеини.

-Модификация на протеини.

-На ниво изследвания, в различни проучвания.

Предимства на протеиназата К

Проведени са няколко сравнителни проучвания между техники за извличане на ДНК, които използват протеиназа К, с други, които не я използват, и всички стигат до извода, че има по-големи ползи при използването на ензима. Предимствата включват следното:

-ДНК с високо молекулно тегло, с високо качество и чистота

-Извлечената ДНК е стабилна до 3 месеца.

Екстрахираната ДНК може да се използва в следните техники: Саут блот, полимеразна верижна реакция (PCR), електрофореза, наред с други.

Устойчиви на протеиназа К протеини

Различни изследвания са заключили, че прионите (анормални токсични PrPSc протеини) се различават от PrPC (нативните) протеини, като са устойчиви на действието на протеиназа К, докато PrPC са чувствителни към неговото действие.

Други автори са описали, че в структурата на PrPSc има чувствителни части и други, устойчиви на протеиназа K. Въпреки това, и двете части са еднакво токсични и инфекциозни.

От друга страна, Bastian и др. През 1987 г. изолират 4 протеина от 28, 30, 66 и 76 kda от вид Spiroplasma mirum. Установено е, че всички са устойчиви на действието на протеиназа К и също имат кръстосана реакция с някои приони.

Известно е, че този вид може да причини катаракта и важни неврологични увреждания и поради научните открития на Бастиан, наред с други изследвания, беше направен опит за свързване на този микроорганизъм с трансмисивни спонгиформни енцефалопатии.

Етиологията на тази дегенеративна неврологична патология обаче продължава да се приписва на прионите и днес.

В този смисъл, Butler и др. През 1991 г. идентифицират и характеризират клас протеин резистентни към протеиназа К от 40 kda от два щама на Mycoplasma hyorhinis. Този патоген засяга прасетата, заразявайки тъканите им, но в този случай не е имало кръстосана реакция с изпитваните приони.

Необходими са повече изследвания, за да се изяснят много неизвестни в това отношение.

Препратки

1. Bastian F, Jennings R и Gardner W. 1987. Antiserum към фибрилен протеин, свързан със скрейпи, кръстосано реагира със Spiroplasma miru m фибрилни протеини. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Оценка на метода за извличане и пречистване на ДНК от мускулна тъкан, фиксирана с формалдехид, на неидентифицирани трупове. Списание Med, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E и Mcgarrity G. Идентифициране и характеристика на протеиназни K-резистентни протеини в членовете на класа Mollicutes. Инфекция и имунитет, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. Лопес М, Ривера М, Виетри М, Ларес М, Морокоима А, Херера Л и др. Сравнение на два протокола за екстракция на DNA на Trypanosoma cruzi, отглеждани в аксенова среда. Преподобни Перу. Медицински опит Обществено здраве 2014; 31 (2): 222-227. Достъпно на: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E и Palma W. Определяне на ефективността на пет протокола за извличане на ДНК от парафинизиран материал за молекулярни изследвания. Преподобни Мед Унив Коста Рика. 2007; 1 (1): 10-19.