РЕКОМБИНАНТНА ДНК: ТЕХНИКА, ПРИЛОЖЕНИЯ И ОСНОВИ - БИОЛОГИЯ - 2025

На рекомбинантна ДНК (рДНК или рДНК) е изкуствен молекула нуклеинова киселина създадени в лабораторни условия, чрез интегриране на два сегмента на интерес организации. Известен е още като химерна ДНК, благодарение на своето хибридно свойство. Този вид ДНК не се среща в природата.

Основната методология за нейното генериране включва: (а) селекцията на целева ДНК и вмъкването й в друг ДНК фрагмент (обикновено бактериален плазмид); (б) въвеждането на този плазмид в бактерия, (в) селекцията на бактериите с помощта на антибиотици и накрая (г) експресията на гена.

Източник: pixabay.com

Техниката се възползва от набор от ензими, които правят възможно копирането и залепването на специфични фрагменти от ДНК според преценката на изследователя.

Целта на рекомбинантната технология в повечето случаи е експресията на протеин (известен като рекомбинантен протеин), желан от молекулярния биолог за бъдещи изследвания или за създаване на протеин с търговска и терапевтична стойност - например човешки инсулин, т.е. например.

Основи на рекомбинантната ДНК техника и нейното използване в генното инженерство

Централната догма на молекулярната биология

Всички органични същества, които познаваме, споделят няколко характеристики. Едно от тях е естеството на генетичния материал и начинът на производство на протеини - процес, известен като централната „догма“ на молекулярната биология.

С изключение на няколко вируса, всички организми съхраняват генетична информация в ДНК (дезоксирибонуклеинова киселина), събрана по много компактен и организиран начин в ядрото на клетката.

За генната експресия, молекулата на ДНК се транскрибира в месинджърната РНК, а последната се превежда на езика на аминокиселините, градивните елементи на протеините.

Какво е рекомбинантна ДНК?

Между 70-те и 80-те години на миналия век молекулярните биолози започват да се възползват от процесите, които протичат естествено вътре в клетката и успяват да ги екстраполират в лабораторията.

По този начин ген от животински произход (гръбначен, например) може да бъде вмъкнат в сегмент от ДНК от бактерия; или ДНК на бактерия може да се комбинира с вирусна ДНК. По този начин можем да определим рекомбинантна ДНК като молекула, съставена от ДНК от два различни организма.

След като се създаде тази хибридна или рекомбинантна молекула, генът на интерес се експресира. С думата израз искаме да се отнасяме към процеса на превод на протеин.

Рестрикционни ензими и лигази: ключът към процеса

Ключов елемент в разработването на рекомбинантна ДНК технология беше откриването на рестрикционни ензими.

Това са протеинови молекули, които проявяват способността за разцепване на ДНК (нуклеази) в специфични последователности, служещи като „молекулярни ножици“. Фрагментите, генерирани от тези ензими, се наричат ​​рестрикционни фрагменти.

Споменатите ензими могат да произвеждат симетрични разрези в целевата последователност (и в двете вериги на една и съща височина) или асиметрични разрези. Ключов аспект на действието на рестрикционните ензими е, че след разцепване на веригата се получава "разхлабен ръб", допълващ другия ръб, отрязан от същия ензим.

Някои примери са ECOR 1 и Sma 1. Понастоящем повече от 200 вида рестрикционни ензими са известни и се предлагат в търговската мрежа.

За да бъде полезно, ножицата трябва да бъде придружена от лепилото. Това уплътняващо действие на ДНК (предварително третирана с рестрикционни ензими) се осъществява от лигази.

Техника: как ДНК на организъм изкуствено се променя в лабораторията?

По-долу ще опишем основните стъпки, които рекомбинантната ДНК технология изисква. Всички те се извършват от професионалисти в лаборатория за молекулярна биология.

Какво е "клонинг"?

Преди да продължим с експерименталния протокол, трябва да отбележим, че в молекулярната биология и биотехнологията терминът "клониране" и глаголът "клон" са широко използвани. Това може да доведе до объркване.

В този контекст нямаме предвид клонирането на цял организъм (както в случая с известната овца Доли, например), а за клонирането на парче ДНК, което може да бъде ген. Тоест, създаване на много копия - генетично идентични - от последователността.

1. Изолиране и получаване на ДНК

Първата стъпка е да решите коя последователност искате да използвате. Това зависи изцяло от изследователя и целите на неговата работа. След това тази ДНК трябва да бъде изолирана и пречистена. Методите и процедурите за постигане на това зависят от своя страна от тялото и тъканта.

Обикновено се взема част от тъкан и се подлага на лечение в буфер за лизис с протеиназа К (протеолитичен ензим) и след това ДНК се екстрахира. Впоследствие генетичният материал се фрагментира на малки фрагменти.

2. Клониращ вектор

След подготвителните стъпки изследователят се стреми да въведе ДНК сегмента от интерес във вектора на клониране. Отсега нататък ще наричаме този сегмент от ДНК бяла ДНК.

плазмиди

Един от най-използваните вектори в плазмид с бактериален произход. Плазмидът е двуверижна, кръгова молекула на ДНК, която се намира естествено в бактериите. Те са чужди на бактериалната хромозома - тоест те са екстрахромозомни и се намират естествено в тези прокариоти.

Основните елементи на вектора са: (а) произход на репликация, който позволява синтеза на ДНК; (б) селектиращ агент, който позволява да се идентифицират организмите, които носят плазмида с целевата ДНК, като резистентност към някакъв антибиотик; и (c) мултиклониращ сайт, където са открити последователностите, които ще бъдат разпознати от рестрикционните ензими.

Първата успешна рекомбинантна ДНК в лабораторията беше клонирана в плазмида pSC101 от бактерията Е. coli. Това съдържа рестрикционен сайт за рестрикционния ензим EcoRI и ген за резистентност към антибиотик в допълнение към произхода на репликацията.

Вмъкването на целевата ДНК в плазмида се извършва с помощта на молекулярните инструменти на рестрикционни ензими и лигази, описани в предишния раздел.

Оставащи типове вектори

В допълнение към плазмидите, ДНК може да бъде вкарана в други вектори, като бактериофага ламбда, космиди, YACs (дрождови изкуствени хромозоми), BACs (бактериални изкуствени хромозоми) и фагемиди.

3. Въвеждане на рекомбинантна ДНК

След като е получена рекомбинантната молекула на ДНК (ген, представляващ интерес към плазмида или друг вектор), тя се въвежда в гостоприемник или гостоприемник, който може да бъде бактерия.

За въвеждане на чужда ДНК в бактерия се използва техника, наречена бактериална трансформация, при която организмът е подложен на лечение с двувалентни катиони, което го прави податлив на поемане на ДНК.

Методологически не можем да гарантираме, че 100% от бактериите в нашата култура ефективно са поели нашата рекомбинантна ДНК молекула. Тук влиза в игра частта от плазмида, която съдържа антибиотична резистентност.

По този начин бактериите, поели плазмида, ще бъдат резистентни към определен антибиотик. За да ги изберете, ще бъде достатъчно да приложите споменатия антибиотик и да вземете оцелелите.

4. "Прибиране" на протеина

След като селектираме бактериите с нашата рекомбинантна ДНК, продължаваме да използваме ензимната машина на гостоприемника, за да генерираме белтъчния продукт, който представлява интерес. Докато бактериите се възпроизвеждат, плазмидът се предава на тяхното потомство, така че той не се губи по време на разделянето.

Тази процедура използва бактериите като вид протеин "фабрика". По-късно ще видим, че това е била много уместна процедура при разработването на ефективни медицински лечения.

След като културата е готова и бактериите са произвели големи количества протеин, клетката се лизира или разрушава. Съществува широк спектър от биохимични техники, които позволяват пречистването на протеините според техните физико-химични характеристики.

В друг експериментален контекст може да не сме заинтересовани да генерираме протеина, а по-скоро сме заинтересовани да получим последователността на ДНК като такава. Ако това беше така, плазмидът ще бъде използван за създаване на множество копия на интересния фрагмент, за да има достатъчно от целевата ДНК, за да извърши съответните експерименти.

Приложения

Рекомбинантната ДНК технология отвори неограничен брой възможности в молекулярната биология, биотехнологията, медицината и други свързани области. Най-забележителните му приложения са следните.

Генетичен анализ

Първото приложение е пряко свързано с лаборатории за молекулярна биология. Рекомбинантната ДНК технология дава възможност на изследователите да разберат нормалната функция на гените и генерираните протеини могат да бъдат използвани в допълнителни изследвания.

Фармацевтична индустрия

Протеините, получени с помощта на рекомбинантната ДНК процедура, имат приложения в медицината. Два много подходящи примера в тази област са човешкият инсулин и хормонът на растежа, който се прилага при пациенти, които нямат този протеин.

Благодарение на рекомбинантната ДНК, тези протеини могат да бъдат генерирани без необходимост от извличането им от друго човешко същество, което представлява допълнителни методически усложнения и рискове за здравето. Това е помогнало да се подобри качеството на живот на безброй пациенти.

Препратки

1. Baca, LEL, & Álvarez, CLC (2015). Биология 2. Grupo редакция Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE, & Hausman, RE (2000). Клетката: молекулен подход (том 10). Вашингтон, окръг Колумбия: ASM press.
3. Devlin, TM (2004). Биохимия: учебник с клинични приложения. Обърнах се.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Роля на рекомбинантната ДНК технология за подобряване на живота. Международно списание за геномиката, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Патологична анатомия. Elsevier Испания.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). Въведение в микробиологията. Panamerican Medical Ed.
7. The MJ (1989). Човешки инсулин: първото лекарство на ДНК технологията. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.