ДАПИ (4 ', 6-ДИАМИДИНО-2-ФЕНИЛИНДОЛ): ХАРАКТЕРИСТИКИ, ОБОСНОВКА, УПОТРЕБА - ХИМИЯ - 2025

На DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол) е багрило чрез флуоресцентна собственост служи като един маркер, широко използвани в областта на флуоресцентна микроскопия или поточна цитометрия, между другото. Флуоресценцията, която излъчва, е ярко синя, възбуждането й става между 455-461 nm (UV светлина).

DAPI багрилото може да премине през клетъчната мембрана на мъртвите клетки с голяма лекота. Той също може да оцвети ядрата на живите клетки, но в този случай концентрацията на това трябва да бъде по-висока.

Химична структура на флуоресцентното багрило DAPI. Източник: Изображение: Файл: DAPI.svg е векторна версия на този файл. Той трябва да се използва вместо това растерно изображение, когато не е по-нисък / Ричард Уилър (Зефирис) Редактирано изображение

Багрилото е в състояние да получи достъп до клетъчна ДНК, за което има специален афинитет, свързвайки се с голяма страст към азотните основи аденин и тимин. Поради тази причина е много полезно в някои техники на молекулярна биология.

Това съединение принадлежи към групата на индоловите багрила и е доказано, че има по-голяма чувствителност към ДНК от етидиев бромид и пропидиев йодид, особено върху агарозни гелове.

Използването на това флуоресцентно багрило е много широко, тъй като е полезно за: изучаване на промените в ДНК при апоптотични процеси (клетъчна смърт) и следователно откриване на клетки в този процес; за ДНК снимка отпечатък (ДНК фотопечат); за изследване на бактериално замърсяване; или за визуализиране на ядрената сегментация.

Използва се и при изследване на хромозомни ленти, при откриване на Mycoplasmas sp DNA, при взаимодействието между ДНК и протеини, при оцветяване и преброяване на клетките чрез имунофлуоресценция и дори за оцветяване на зрели цветен прашец.

характеристики

DAPI е съкращението на химичното му наименование (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол). Молекулната му формула е C ₁₆ H ₁₅ N _5. Има молекулно тегло 350,3. В близост до диапазона на ултравиолетовата светлина (345 до 358 nm) настъпва максималното възбуждане на комплекса DAPI-DNA, докато максималната емисия на флуоресценция възниква между 455-461 nm.

Това багрило се характеризира като жълт прах, но структурите, маркирани с този флуорофор, излъчват блестяща синя светлина.

Това е съединение, разтворимо във вода, но за да се ускори неговото разтваряне, може да се приложи известна топлина. Може да се разрежда с PBS, но не да се разтваря директно в него.

След като багрилото се приготви, то трябва да се съхранява на тъмно, тоест защитено от светлина, при температура от 2 до 8 ° C (хладилник). При тези условия багрилото е стабилно за повече от 3 седмици или месеци.

Ако е защитен от светлина, но оставен на стайна температура, стабилността му пада до 2 или 3 седмици, но изложена на пряка светлина, влошаването става много бързо. Ако искате да съхранявате много по-дълго, той може да бъде хладилник при -20 ° C, разпределен в аликвоти.

основа

Това оцветяване се основава на генериране на ядрен контраст в основните техники за молекулярна биология, като: поточна цитометрия, флуоресцентна микроскопия и оцветяване на метафазни хромозоми или междуфазни ядра, наред с други.

Тази техника се основава на големия афинитет, който багрилото има към азотните основи (аденин и тимин), съдържащи се в генетичния материал (ДНК) в второстепенния канал. Докато е на цитоплазмено ниво, той оставя много малък фон.

Когато флуоресцентното багрило се свърже с адениновите и тиминовите участъци на ДНК, флуоресценцията се увеличава значително (20 пъти повече). Цветът, който излъчва, е ярко син. По-специално, няма флуоресцентно излъчване при свързване към базови двойки GC (гуанин-цитозин).

Важно е да се отбележи, че макар и да има афинитет към РНК, това не създава проблем, тъй като най-високата степен на излъчване на енергия от тази молекула се проявява на друга дължина на вълната (500 nm), за разлика от ДНК, което прави това при 460 нм. Освен това, увеличението на флуоресценцията веднъж свързана с РНК е само 20%.

DAPI се използва повече за оцветяване на мъртви (фиксирани) клетки, отколкото живи клетки, тъй като за оцветяването на последните е необходима много по-висока концентрация на багрилото, това е така, защото клетъчната мембрана е много по-малко пропусклива за DAPI, когато е жива.

DAPI багрилото може да се използва в комбинация с червени и зелени флуорофори за многоцветно изживяване.

употреба

DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол) е отличен флуорофор и затова е широко използван в различни техники и за различни цели. Следното обяснява използването на DAPI в основните техники.

Проточна цитометрия

Изследователите Gohde, Schumann и Zante през 1978 г. бяха първите, които използват и предлагат DAPI като флуорофор в техниката на поточна цитометрия, имайки голям успех поради високата си чувствителност към ДНК и високата си интензивност при флуоресцентна емисия.

Използването на DAPI в тази техника позволява изследване на клетъчния цикъл, количественото определяне на клетките и оцветяването на живи и мъртви клетки.

Въпреки че има и други оцветители, като етидиев бромид, Hoechst оксид, акридин оранжев и пропидиев йодид, DAPI е един от най-широко използваните, тъй като е по-фотостабилен от споменатите по-рано.

За тази техника е необходимо да се фиксират клетките, за това може да се използва абсолютен етанол или 4% параформалдехид. Пробата се центрофугира и супернатантата се изхвърля, впоследствие клетките се хидратират чрез добавяне на 5 ml PBS буфер за 15 минути.

Докато изтече времето, подгответе DAPI оцветяването с оцветяващ буфер (FOXP3 от BioLegend) в концентрация 3 цМ.

Центрофугирайте пробата, изхвърлете супернатантата и след това покрийте с 1 ml разтвор на DAPI в продължение на 15 минути при стайна температура.

Вземете пробата в цитометъра с подходящ лазер.

Микрофлуорометрия на потока

Друга техника, при която се използва DAPI, е микрофлуорометрията на потока заедно с друг флуорофор, наречен митрамицин. И двете са полезни за количествено определяне на ДНК на хлоропласт поотделно, но DAPI е най-подходящ за измерване на Т4 частици бактериофаг.

Хибридизацията

Тази техника използва основно ДНК сонди, етикетирани с флуоресцентно багрило, което може да бъде DAPI.

Пробата изисква топлинна обработка за денатуриране на двуверижната ДНК и превръщането й в две едноверижни вериги. Впоследствие се хибридизира с DAPI-белязана денатурирана ДНК сонда, която има интересна последователност.

По-късно се промива, за да се елиминира онова, което не е било хибридизирано, за визуализиране на ДНК се използва контраст. Флуоресцентният микроскоп позволява наблюдението на хибридизираната сонда.

Тази техника има за цел да открие специфични последователности в хромозомната ДНК, да може да постави диагнозата на определени заболявания.

Тези цитомолекулни техники са били от голяма полза при определяне на детайлите при изследването на кариотипите. Например, той показа областите, богати на основни двойки на аденозин и тимин, наречени хетерохроматични региони или DAPI ленти.

Тази техника се използва широко за изследване на хромозоми и хроматин при растения и животни, както и при диагностициране на пренатални и хематологични патологии при хора.

При тази техника препоръчителната концентрация на DAPI е 150 ng / ml за време от 15 минути.

Сглобените пързалки трябва да се съхраняват защитени от светлина при 2-8 ° C.

Имунофлуоресцентно оцветяване

Клетките се фиксират с 4% параформалдехид. Ако трябва да се използват други петна, DAPI се оставя в края като противоположно и клетките се покриват с PBS разтвор за 15 минути. Докато изтече времето, пригответе DAPI разтвора чрез разреждане с PBS, така че крайната концентрация да е 300 цМ.

След това излишъкът от PBS се отстранява и се покрива с DAPI в продължение на 5 минути. Измива няколко пъти. Слайдът се гледа под флуоресцентен микроскоп под подходящия филтър.

Лист за безопасност

С това съединение трябва да се работи внимателно, тъй като това е съединение, което има мутагенни свойства. Активираният въглен се използва за елиминиране на това съединение от водни разтвори, които трябва да бъдат изхвърлени.

Трябва да се използват ръкавици, рокля и предпазни очила, за да се избегнат злополуки с този реагент. При контакт с кожата или лигавицата областта трябва да се измие с достатъчно вода.

Никога не трябва да пипетирате този реагент през устата, използвайте пипети.

Не замърсявайте реагента с микробни агенти, тъй като това ще доведе до грешни резултати.

Не разреждайте петното DAPI повече от препоръчителното, тъй като това значително ще намали качеството на петното.

Не излагайте реагента на пряка светлина, нито поддържайте топло, тъй като това намалява флуоресценцията.

Препратки

1. Brammer S, Toniazzo C и Poersch L. Corantes, често участващи в цитогенетиката на растенията. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Достъпно от: scielo.
2. Импат лаборатории. DAPI. Достъпно на: menarinidiagnostics.com/
3. Цитоклеточни лаборатории. 2019. Инструкции за употреба на DAPI. достъпна на cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Понятия и техники в речната екология. (2009 г.). Редакционно Rubes, Испания. Достъпно на адрес: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Използване на флуоресценция в модифициран дисектор метод за оценка на броя на миоцитите в сърдечната тъкан. Арх. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Предлага се от: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Наличие на фитоплазми при папая (Carica papaya) в Мексико. Списание Chapingo Серия по градинарство, 2011 г.; 17 (1), 47-50. Достъпно на: scielo.org.