СТАНДАРТНО АГАРНО ЗЪРНО: ОБОСНОВКА, ПРИГОТВЯНЕ И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЯ - 2025

На агара е стандарт не е по - селективен, твърда хранителна среда, предназначена за количествено определяне на настоящето микробно натоварване в аеробни проби питейна вода, отпадъчни води, млечни напитки и други храни. Тази среда е известна още като PCA агар, заради съкращението си на английски Plate Count Agar. Той е създаден през 1953 г. от Бухбиндер, Барис и Голдщайн.

Стандартната среда за агар е съставена от екстракт от дрожди, триптеин, глюкоза, агар и дестилирана вода. Тази формулировка съдържа основни хранителни елементи, които позволяват развитието на настоящия аеробен микробен товар, не изискващ.

Десетични разреждания за преброяване на CFU в стандартни броя на агар. Източник: Куентин Гейсман

Тъй като средата не съдържа инхибитори, бактериите могат да растат без ограничения, което я прави идеална за общо преброяване на колонии. Техниката за количествено определяне на плаката обаче няма да открие всички налични бактерии, а само онези, които са в състояние да растат при условията на околната среда, на които е подложен стандартният брой агар.

В този смисъл техниката за количествено определяне на плочата обикновено се стреми да определи количеството бактерии от аеробния мезофилен тип, тоест тези, които растат при температури между 25 и 40 ° С, с оптимална температура на растеж 37 ° С., Тази бактериална група е много важна, защото там се намират повечето патогенни бактерии за човека.

Трябва да се отбележи, че понякога може да е интересно да се определи количеството на психрофилните бактерии, присъстващи в храната. Тези бактерии са тези, които растат при ниски температури (<20 ° C) и са отговорни за причиняването на храната да се разлага по-бързо, дори когато се охлажда.

По същия начин термофилните бактерии, които се развиват в диапазон между 50 ° C и 80 ° C или повече, могат да бъдат важни за някои видове храни, като консерви.

Микробиалното количествено определяне се изразява в колони образуващи колони (CFU) на грам или милилитър от пробата.

основа

Стандартната среда за броене е проектирана така, че да позволи успешния растеж на не-бързи аеробни бактерии, тъй като екстрактът от дрожди, триптеин и глюкоза осигуряват необходимите хранителни вещества за добрия растеж на микробите.

От друга страна, средата има светъл цвят и прозрачен вид, поради което е идеална за визуализация на колонии, разработени по метода на дълбоко засяване (изсипване в чиния).

Възможно е и преброяване на колониите по метода на засяване на повърхността с шпатула Drigalski.

Когато микробното натоварване е високо, трябва да се направят десетични разреждания на изследваната проба, за да могат да се отчитат CFU.

Трябва да се отбележи, че тази среда се препоръчва от Американската асоциация за обществено здраве (APHA) за броя на аеробните мезофили.

подготовка

Претеглят се 23,5 g от дехидратираната среда и се разтварят в литър дестилирана вода. За да се разтвори напълно, сместа трябва да се загрява, като се бърка често, докато заври. По-нататъшните стъпки зависят от използваната техника за засяване.

За техниката на изливане на плочи

Разпределете чрез дозиране на 12 до 15 ml в епруветки. Впоследствие стерилизирайте в автоклав при 121 ° С в продължение на 15 минути. Оставете да се втвърди вертикално във формата на блок. Съхранявайте в хладилник до употреба.

Разтопете щепсела, когато ще го използвате. След като се разтопи, дръжте го на водна баня при 44-47 ° C, докато пробите се приготвят.

За повърхностна сеитба

Стерилизирайте средата в автоклав при 121 ° С и след това разпределете 20 ml в стерилни чаши на Петри. Оставете да се втвърди, обърнете и съхранявайте в хладилника до употреба.

Преди употреба. РН на средата трябва да бъде 7,0 ± 0,2.

употреба

Стандартният граф агар се използва в аеробния метод на мезофилно броене по време на микробиологичен анализ на вода и храна. Броят на аеробните мезофили е необходим, тъй като той определя санитарното качество на изследваната проба.

Прилагането на тази техника (използвайки тази среда) позволява макроскопска визуализация на изолирани колонии за тяхното количествено определяне.

Техника за изливане на плочи (дълбоко засяване)

-Process

Техниката се състои в следното:

1) Хомогенизирайте пробата, за да преразпределите присъстващите бактерии.

2) Първоначална суспензия се прави в стерилна бутилка или плик, като се спазва съотношението 10 gr или 10 ml от пробата в 90 ml разредител (10 ^-1).

3) От първоначалната суспензия се правят съответните десетични разреждания в зависимост от вида на пробата. Пример: (10 ^-2, 10 ^-3, 10 ^-4). Разрежданията се правят с пептонова вода или фосфатен буфер.

За целта вземете 1 ml от първоначалната суспензия и я поставете в 9 ml разредител, продължете разрежданията, ако е необходимо, като сега вземете 1 ml от разреждането 10 ^-2 и така нататък.

4) Вземете 1 ml от всяко разреждане и поставете в празни стерилни чаши Петри.

5) Към всяка плака се прибавят 12 до 15 ml стандартен агар, предварително разтопен и уреден при 44 - 47 ° C.

6) Въртете плаките внимателно, за да разпределите пробата по агара равномерно и оставете да се втвърди.

7) Обърнете плочите и инкубирайте при 37 ° С в аеробиоза за 24 до 48 часа.

8) В края на времето плаките се изследват и колониите се отчитат при разреждането, което го позволява. Онези плочи, които имат между 30 и 300 CFU, се избират за броя.

Преброяването може да се извърши ръчно или можете да използвате брояча на колоните.

Разрешените стойности за ml от пробата могат да варират в отделни държави в зависимост от разпоредбите, на които се управляват.

-Изчисляване на UFC

Общото изчисление се извършва по следната формула:

Формула за общото изчисляване на количественото определяне на CFU. Източник: Национална администрация по лекарства, храни и медицински технологии (ANMAT). Микробиологичен анализ на храните, официална аналитична методология, индикаторни микроорганизми. 2014 том 3. Достъпно на: anmat.gov.ar

Резултатите се изразяват в 1 или 2 цифри, като се умножават по съответната основа 10. Пример: ако резултатът е 16 555, той се закръгля на базата на третата цифра до 17 000 и ще се изрази по следния начин: 1,7 x 10 ⁴. Сега, ако резултатът беше 16,436, закръглете го до 16 000 и изразете 1,6 x 10 ⁴.

Техника за повърхностно засяване

-Process

-Inocular с 0,1 ml от директната проба, ако е течна, първоначална суспензия 10 ^-1 или от последователните разреждания 10 ^-2, 10 ^-3 и т.н., в центъра на стандартна плоча с агар.

-Разпределете равномерно пробата с шпатула Drigalski или стъклена пръчка с форма на L. Оставете я да почива 10 минути.

-Инвертирайте плаките и инкубирайте аеробно при 37 ° С за 24 до 48 часа.

-Продължете да преброите колониите, изберете онези плочи, които са в диапазон между 20 - 250 CFU.

-Изчисляване на UFC

За изчислението се прилага коефициентът на разреждане, който е обратната. Числото се закръгля до 2 значими цифри (закръгляне според третата цифра) и се изразява в мощност на база 10. Например, ако 224 CFU се преброят в пробата без разреждане (10 ^-1), се отчита 22 x 10 ¹ CFU, но ако цифрата е 225, се отчита 23 x 10 ¹ CFU.

Сега, ако 199 CFU се броят в разреждането 10 ^-3, ще се докладва 20 x 10 ⁴ CFU, но ако 153 CFU се преброят в същото разреждане, ще бъдат отчетени 15 x 10 ⁴ CFU.

QA

Стандартната културална среда за броене може да бъде оценена с помощта на известни сертифицирани щамове, като: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Ако културната среда е в оптимални условия, се очаква задоволителен растеж във всички случаи, с изключение на L. fermentum, който може да има редовен добив.

За да се оцени стерилността на културната среда, една или две плаки от всяка подготвена партида (без инокулация) трябва да се инкубират при 37 ° С в аеробиоза за 24 часа. След това време в средата не трябва да се наблюдава растеж или промяна на цвета.

Ограничения

-Не стопявайте агара повече от веднъж.

-Приготвената среда може да издържи до 3 месеца, докато се съхранява в хладилник и защитена от светлина.

-Тази среда не е подходяща за взискателни или анаеробни микроорганизми.

Препратки

1. Национална администрация по лекарства, храни и медицински технологии (ANMAT). Микробиологичен анализ на храните, официална аналитична методология, индикаторни микроорганизми. 2014 том 3. Достъпно на: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Франсиско Сория Мелгуизо, SA Граф на плочите агар. 2009.Достъпна на:
3. Conda Pronadisa Laboratories. Стандартен метод агар (PCA) съгласно APHA и ISO 4833. Достъпно на: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Брой на плочите с агар 2015.Наличен на: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B и Velázquez O. 2009. Техники за микробиологичен анализ на храните. 2-ро изд. Химически факултет, UNAM. Мексико. Достъпно на: depa.fquim.unam