ТЕСТ НА VOGES-PROSKAUER: ОСНОВА, ПОДГОТОВКА И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЯ - 2025

Тестът Voges-Proskauer е биохимичен тест, използван за подпомагане на идентифицирането на бактерии от семейството на Enterobacteriaceae. Той е особено полезен за диференциране на щамове на Escherichia coli от Klebsiella и Enterobacter, наред с други.

Тестът се провежда в течна културална среда, наречена Methyl Red - Voges Proskauer, по-известна от съкращението RM / VP. Тази среда се състои от буфериран полипептон, глюкоза, дикалиев фосфат и дестилирана вода.

Метил Red-Voges Proskauer (RM / VP) търговска среда / VP тест съответно положителен и отрицателен. Източник: Снимка, направена от автора MSc. Marielsa Gil / Sudipta.nov15, от Wikimedia Commons

Настоящата среда RM / VP е модификация на средата Clark и Lubs, която първоначално съдържа по-ниска концентрация на пептони и глюкоза. По този начин се получава по-малко от водородния йон, необходим за положителната реакция на Voges-Proskauer.

Тестът се основава на способността на микроорганизма да използва глюкоза по пътя на бутилен-гликол и да образува неутрален краен продукт, наречен ацетоин, в присъствието на кислород и алкално рН.

В RM / VP средата, освен че може да разкрие теста на Voges-Proskauer, може да се разкрие и метил червеният тест.

основа

Тест на Voges-Proskauer

Присъстващите в средата плурипептони осигуряват основните хранителни изисквания за растежа на бактериите. От своя страна, глюкозата е основното съединение. Много бактерии имат способността да метаболизират глюкозата и да образуват пирувинова киселина.

Пирувиновата киселина е средна точка в метаболизма на глюкозата и оттам всеки микроорганизъм може да поеме по различни пътища. Някои ще образуват смесени киселини, като млечна киселина, оцетна киселина, мравчена киселина и янтарна киселина, а други ще образуват неутрални продукти като 2,3-бутандиол.

Тестът Voges-Proskauer разкрива способността на микроорганизма да образува ацетил метил карбинол (ацетоин), междинен продукт на 2,3-бутандиол при аеробни условия.

Ацетоинът се редуцира и образува 2,3-бутандиол, но тази реакция е обратима, следователно, ако 2,3-бутандиол се окисли, се образува ацетоин. Следователно кислородът е от съществено значение.

Дикалиев фосфат е буферът, който буферира сместа при рН 6,9 ± 0,2.

Основа за разкриване на доказателства и тълкуване

За да се демонстрира реакцията, трябва да се извърши разработка, като се използват два реагента (Баритови реагенти), известни като Voges A и Voges B.

Voges A е 5% разтвор на α-нафтол, а Voges B е 40% калиев хидроксид. Ако не е наличен калиев хидроксид, той може да бъде заменен с 40% натриев хидроксид.

Α-Нафтол е катализатор, който ще увеличи интензивността на реакционния цвят, като направи теста по-чувствителен. А-нафтолът трябва винаги да се добавя първо, като се разклаща епруветката, така че средата да влезе в контакт с кислорода. По този начин присъстващият ацетоин се окислява до диацетил и 2,3-бутандиол се окислява до образуване на ацетоин, преминавайки този в диацетил.

Ето как α-нафтолът ще се присъедини към диацетил, който от своя страна се присъедини към ядрото на гуанидин, присъстващо в аминокиселината аргинин, като последният идва от плурипептони.

От своя страна, калиев или натриев хидроксид е отговорен за абсорбирането на CO ₂ и реакцията с пептони. Тази реакция предизвиква образуването на сьомго-розов цвят, ясно видим след разклащане на тръбата много добре.

Правилните количества диацетил, пептон и α-нафтол трябва да бъдат смесени, за да се появи цветът незабавно. Ако това не се случи, тръбата се оставя да почива 15 минути, преди да се интерпретира.

Тестът обикновено е положителен след 2 до 5 минути, когато може да се забележи слаб розов цвят. Ако се остави да престои 30 минути до 1 час, интензивността на цвета ще бъде максимална (интензивно червено).

Отрицателният тест ще се покаже, когато бульонът пожълтее. След 1 час, ако тестът е отрицателен, може да се образува меден цвят в резултат на реакцията на калиев хидроксид върху α-нафтол.

подготовка

Средно MR / VP

Претеглят се 17 g от дехидратираната среда за култивиране и се разтварят в литър дестилирана вода. Оставете да престои 5 минути. Загрейте до кипене, за да се разтвори напълно. Сервирайте 3 до 4 ml в епруветки и стерилизирайте в автоклав при 121 ° C за 15 минути.

Дехидратираната културална среда е с бежов цвят, а подготвената среда е светло кехлибарена.

Крайното pH на средата е 6,9 ± 0,2.

Voges Реагент

Претеглят се 5 g α-нафтол и се разтварят в 50 ml етилов алкохол (абсолютно). След това продължете да добавяте етилов алкохол, докато достигне 100 ml.

Реагент Voges B

Претеглят се 40 g калиев хидроксид и се разтварят в 50 ml дестилирана вода в чаша. Стъклото трябва да се постави в студена водна баня за контрол на температурата, защото когато препаратът се разтвори, температурата рязко се повишава.

След като разтворът е студен, той се прехвърля в обемна колба и се допълва до 100 ml с дестилирана вода.

Процедура за тестване на Voges-Proskauer

За да се извърши Voges-Proskauer тест, RM / VP бульон се инокулира с изследвания микроорганизъм, от чиста култура за 18 до 24 часа.

Инокулумът не трябва да е много гъст. Той се инкубира при 35-37 ° С за 24 до 48 часа, въпреки че понякога е необходимо инкубиране в продължение на няколко дни. Cowan and Steel са на мнение, че 5 дни е минималното време за инкубация, необходимо за откриване на всички положителни видове Voges-Proskauer (VP) от семейство Enterobacteriaceae.

Разработване на тестове

Отделете аликвота от 1 ml в епруветка и развийте, както следва: Поставете 12 капки (0,6 ml) Voges A реагент и 4 капки (0,2 ml) Voges B. Смесете за аериране и оставете да се утаи за 5 - 10 минути преди интерпретация. Ако тестът все още е отрицателен, оставете го да седи и наблюдавайте епруветката след 30 минути до 1 час.

Появата на розово-червен цвят показва, че реакцията на Voges-Proskauer е положителна. Ако средата остане жълта, реакцията е отрицателна.

Добавянето на програмисти в посочения ред и количество е от съществено значение, за да се избегнат фалшиви негативи.

употреба

Тестът на Voges-Proskauer е полезен за разграничаване между щамове на E. coli, които са отрицателни на VP, от родовете Klebsiella, Enterobacter, Serratia, между другото, които са VP позитивни.

Източник: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологична диагноза. 5-то изд. Редакция Panamericana SA Аржентина.

QA

Контролни щамове могат да бъдат използвани за тестване на качеството на подготвената среда, включително Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium и Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Очакваните резултати са положителни реакции на Voges-Proskauer само за K. pneumoniae и E. cloacae. Останалите дават отрицателни реакции.

Препратки

1. Britannia Laboratories. MR-VP Medium. 2015. Наличен на: www.britanialab.com
2. Microkit Laboratories. M-Ident Voges Proskauer. 2014. Наличен:
3. Mac Faddin J. (2003). Биохимични тестове за идентифициране на бактерии с клинично значение. 3-то изд. Редакция Panamericana. Буенос Айрес. Аржентина.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Микробиологична диагностика на Бейли и Скот. 12 изд. Редакция Panamericana SA Аржентина.
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологична диагноза. 5-то изд. Редакция Panamericana SA Аржентина.