ОЦВЕТЯВАНЕ НА СПОРИ: ОБОСНОВКА, ТЕХНИКИ И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЯ - 2025

На оцветяването спори е методологията, използвана за боядисване структури резистентност, които са някои бактериални родове когато при неблагоприятни условия; Тези структури съответстват на форма на оцеляване.

Има много родове, които образуват спори; основните от тях обаче са Bacillus и Clostridium. Тези родове се считат за по-уместни, тъй като имат патогенни видове за хората.

Оцветяване на спори по метода на Шефер - Фултън или Виртц-Конклин. И тамбе (оригинален качител), от Wikimedia Commons

Всеки бацил може да породи спора. В момента на оцветяване на препарата, спорите могат да бъдат открити в рамките на бацила (ендоспора) или извън него (екзоспора). При конвенционалните техники за оцветяване на бактерии - като оцветяването по Грам - спорите остават безцветни.

В момента има няколко методологии за оцветяване, които са способни да проникнат в дебелата структура на спорите, за да я боядисат. Тези методологии са много разнообразни; Те включват техниката на Дорнер, оцветяването на Мьолер и методологията на Шефер - Фултън, известна още като Wirtz-Conklin.

От всички споменати техники методологията на Шефер-Фултън е най-широко използваната в рутинните лаборатории. Тя е кръстена на двама микробиолози, които създадоха оцветяването през 1930 г.: Алисия Шефер и Макдоналд Фултън. Техниката обаче понякога е кръстена Wirtz-Conklin след двама бактериолози от 1900-те години.

основа

Спорите не се оцветяват с конвенционални петна, защото имат много дебела стена. Сложният състав на спорите предотвратява навлизането на повечето оцветители.

Ако спората се изследва отвън навътре, се наблюдават следните слоеве: първо, там е екзоспорият, който е най-тънкият и външен слой, изграден от гликопротеини.

Следва кутикулата, която осигурява устойчивост на високи температури, последвана от кората, съставена от пептидогликан. По-късно е стената на основата, която защитава протопласта.

Спората е дехидратирана структура, която съдържа 15% калций и дипиколинова киселина. Ето защо повечето техники за оцветяване на спори разчитат на прилагането на топлина, така че багрилото да може да проникне в дебелата структура.

След като спората е оцветена, тя не може да премахне багрилото. В техниката на Шейфер - Фултън, малахитовото зелено навлиза във вегетативните клетки и когато се прилага топлина, прониква в ендоспора, както и в екзоспорите.

Чрез измиване с вода багрилото се отстранява от вегетативната клетка. Това се случва, защото малахитовото зелено багрило е леко основно, така че се свързва слабо с вегетативната клетка.

Вместо това не може да се измъкне от спорите и в крайна сметка бацилът се противопоставя на сафранина. Тази основа е валидна за останалите техники, в които се случва нещо подобно.

Техники за оцветяване на спори

За да се извърши оцветяването на спорите, трябва да се получи чиста култура на подозрителния щам, който трябва да се изследва.

Културата се подлага на екстремни температури в продължение на 24 часа, за да се стимулира микроорганизмът да спорира. За това културата може да бъде поставена във фурна при 44 ° C или в хладилник (8 ° C) за 24 или 48 часа.

Ако се остави твърде дълго при споменатите температури, ще се наблюдават само екзоспори, тъй като всички ендоспори вече са излезли от бацила.

В края на времето трябва да се поставят няколко капки стерилен физиологичен разтвор върху чиста пързалка. След това се взема малка част от културата и се прави фино намазване.

След това се оставя да изсъхне, фиксира се в топлината и се боядисва с една от техниките, обяснени по-долу:

Техника на Дорнер

1- Пригответе в епруветка концентрирана суспензия на споролизирания микроорганизъм в дестилирана вода и добавете равен обем филтриран Kinyoun carbol fuchsin.

2- Поставете епруветката във вана с вряла вода за между 5 и 10 минути.

3- На чист слайд смесете капка от предишната суспензия с капка 10% воден разтвор на нигрозин, сварен и филтриран.

4- Разстелете и подсушете бързо с нежна топлина.

5- Проучете със 100X цел (потапяне).

Спорите оцветяват червено, а бактериалните клетки изглеждат почти безцветни на тъмносив фон.

Модифицирана техника на Дорнер

1- Суспензия на споролизирания микроорганизъм се разпространява върху пързалка и се фиксира в топлината.

2- Пробата се покрива с лента с филтърна хартия, към която се добавя карбол фуксин. Оцветителят се нагрява в продължение на 5 до 7 минути с пламъка на Бунзенова горелка, докато не се генерират изпарения. Тогава хартията се отстранява.

3- Препаратът се промива с вода и след това се изсушава с абсорбираща хартия.

4- Покрийте намазката с тънък филм от 10% нигрозин, като използвате втори слайд, за да разнесете нигрозин или игла.

Оцветяването от спорите и бактериите е същото като описаното в предшестващото състояние на техниката.

Шефер - техника на Фултън или Виртц-Конклин

1- Направете фина намазка със суспензия на споровия микроорганизъм върху пързалка и фиксирайте за нагряване.

2- Покрийте пързалката с 5% воден разтвор на малахит (можете да поставите филтърна хартия върху слайда).

3- Загрейте пламъка на горелката Bunsen, за да предизвикате отделянето на пари и да премахнете пламъка. Повторете операцията за 6 до 10 минути. Ако по време на процедурата малахитовият зелен разтвор се изпари твърде много, може да се добави още.

4- Извадете филтърната хартия (ако е инсталирана) и измийте с вода.

5- Покрийте пързалката с 0,5% воден сафранин за 30 секунди (някои варианти на техниката използват 0,1% воден сафранин и го оставете за 3 минути).

При тази техника спорите изглеждат зелени, а бацилите - червени.

Недостатъкът е, че ендоспорите на младите култури не оцветяват добре, тъй като изглеждат изключително бистри или безцветни. За да се избегне това, се препоръчва да се използват култури с инкубация от 48 часа.

Техника на Мьолер

1- Покрийте намазката с хлороформ за 2 минути.

2- Изхвърлете хлороформа.

3- Покрийте с 5% хромова киселина за 5 минути.

4- Измийте с дестилирана вода

5- Листът е покрит с карбол фуксин-феникада и е изложен на пламъка на горелката Бунсен до изпускане на пари; след това се отстранява от пламъка за няколко мига. Операцията се повтаря до приключване на 10 минути.

6- Измийте с вода.

7- Използвайте подкислен етанол (солен алкохол), за да обезцвети. Оставя се за 20 или 30 секунди.

8- Измийте с дестилирана вода.

9 - Контрастирайте, като покриете листа с метиленово синьо за 5 минути.

10- Измийте с дестилирана вода.

11- Оставете го да изсъхне и пробата се взема на микроскоп.

Спорите изглеждат червени, а бацилите - сини. Важно е да не вдишвате изпаренията, тъй като те са токсични и в дългосрочен план могат да бъдат канцерогенни.

Модифицирана техника на Мьолер без топлина

През 2007 г. Хаяма и неговите сътрудници създават модификация на техниката на Мьолер. Те елиминират етапа на нагряване на багрилото и го заместват, като добавят 2 капки повърхностно активното вещество Tergitol 7 за всеки 10 ml разтвор на карбол фуксин-карбол. Получени са същите резултати.

Приложения

Оцветяването на спорите предоставя много ценна и полезна информация за идентифицирането на патогена, тъй като неговото присъствие, неговата форма, местоположение в рамките на бацила и способността да деформира вегетативната клетка или не, са данни, които могат да ръководят вида участва в определен жанр.

В този контекст си струва да се каже, че спорите могат да бъдат кръгли или овални, могат да бъдат разположени в центъра или също в парацентрално, субминално или крайно положение.

Диаграма на формата и положението на ендоспорите и екзоспорите

Примери

- Clostridium difficile образува овална спора в терминално положение, която деформира бацила.

- Спората на Clostridium tertium е овална, не деформира бацила и е разположена на терминално ниво.

- Ендоспората на Clostridium tetani е терминална и деформира бацила, придавайки вид на барабанна пръчка.

- Спорите на Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy и C. septicum са кръгли или овални субтерминални и деформират бацила.

- Ендоспората на Clostridium sordelli е разположена в централно положение, с лека деформация.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологична диагноза. (5-то изд.). Аржентина, редакция Panamericana SA

Препратки

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Предложение за опростена техника за оцветяване на бактериални спори без прилагане на топлина - успешна модификация на метода на Moeller. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Сътрудници на Уикипедия Петно от Moeller. Уикипедия, Свободната енциклопедия. 3 ноември 2018 г., 03:28 UTC. Достъпно на: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Наръчник за микробиологични техники. Катедра по основни науки Академия по микробиология. Национален политехнически институт.
4. "Endospore". Уикипедия, Свободната енциклопедия. 25 февруари 2018 г., 10:20 UTC. 10 януари 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J и сътрудници. (2006 г.). Трудов персонал на автономната общност на Естремадура. Специфична програма том IV. Редакционен MAD. Севиля-Испания, стр. 211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006).Специализиран лаборант, Галикийска здравна служба (SERGAS). Том на специфичния дневен ред 2. Редакционен MAD. Севиля-Испания, стр. 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологична диагноза. (5-то изд.). Аржентина, редакция Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Микробиологична диагностика на Бейли и Скот. 12 изд. Аржентина. Редакция Panamericana SA