ОЦВЕТЯВАНЕ НА РАЙТ: ОБОСНОВКА, МАТЕРИАЛИ, ТЕХНИКА И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЯ

Петното от Райт е техника за оцветяване, създадена от американския патолог Джеймс Омир Райт през 1902 г., базирана на петното от Романовски. Тъй като петното от Романовски беше нестабилно, Райт включи метанол като разтворител и фиксатор.

Това оцветяване е полихроматично, което означава, че генерира няколко цвята в зависимост от структурата, която абсорбира багрилото. Тази техника на оцветяване е широко използвана за извършване на диференциран брой на белите кръвни клетки и за изследване на морфологията на червените кръвни клетки, тромбоцитите и левкоцитите в периферната кръв и костния мозък.

Различни петна от периферна кръв, оцветени с петно на Райт. А. Остра левкемия B. Плазмодий вивакс в еритроцита. В. Plasmodium falciparum, макрогаметоцит. D. Лимфоцит

Приложението му е много важно, тъй като в различните клетъчни линии на кръвта могат да се наблюдават аномалии, улесняващи диагностицирането на заболявания като левкемия или бактериални или паразитни инфекции.

Може би това са най-често срещаните приложения, в които се използва тази техника, но те не са единствените. Също така е полезен в проби, различни от кръв и костен мозък, като назален секрет, фекална слуз, храчки, кожни проби, наред с други.

Обосновка за оцветяването на Райт

Петното на Райт се е родило от петното на Романовски, което се състои от метилов алкохолен разтвор на кисело багрило (еозин Y) и основно багрило (метиленово синьо) и техните продукти на окисляване.

Сместа от багрила, използвана в оцветяването на Райт, предизвиква ефекта, известен като Романовски, тоест дава красиво лилаво оцветяване на ядрата на левкоцитите и неутрофилните гранули, докато червените кръвни клетки оцветяват розово.

Компонентите, отговорни за придаването на типичната цветова гама на оцветяването на Райт, са синьо B и еозин Y. Наблюдаваният ефект ще зависи от свързването на багрилата с химичните структури и от взаимодействията на син B и еозин Y.

Киселинните структури като нуклеинови киселини, ядрени протеини и реактивната незряла цитоплазма на някои видове клетки фиксират синьо B (основно петно).

Докато основни структури като хемоглобин, гранулите на сегментирани еозинофили, сред другите клетъчни структури, свързват еозин Y (кисело багрило).

Резултатът от оцветяването може да бъде повлиян от различни фактори, като рН на багрилото на Райт, буфера и разтвора за промиване; както и времето за оцветяване и фиксиране.

Следователно, всяка стъпка в приготвянето на реагентите е от решаващо значение и трябва да се извърши с внимание към всеки детайл.

материали

Райт петно. За 100 мл се изисква:

Претеглете 0,3 g петно на Райт, измерете 97 ml метанол и 3 ml глицерол.

подготовка

В хоросан поставете голямото количество оцветител на Райт и постепенно включете глицерола, докато прахът се разтвори напълно.

Впоследствие метанолът се добавя, разбърква се и се налива в кехлибарена бутилка.

Преди употреба разтворът трябва да се разклати с нежни движения и да се филтрира.

Буферен разтвор на буфер

В един литър дестилирана вода се добавят 3,76 g динатриев хидрофосфат (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0) плюс 2,1 g дихидроген калиев фосфат (KH ₂ PO ₄).

Смесете много добре, докато всички включени реагенти се разтворят. Регулирайте pH до 7,2. Изсипете в стъклен буркан и дръжте на стайна температура.

Допълнителни материали, необходими за извършване на оцветяването

Освен това са необходими и други материали, за да може да се извърши техниката на оцветяване, това са: предметни пързалки или калъфи, оцветяващ мост, тениски с вода или буфер за измиване, хронометър за запазване на времето за оцветяване и малко сушилен материал (абсорбираща хартия, марля или памук).

Компоненти на петна на Райт

Метан

Алкохолът (метанолът) служи като фиксиращо средство за намазването на кръвта към пързалката.

Основно е реагент за редуциране, дехидратиране и фиксиране на коагулант. Следователно неговата функция е да коагулира протеините и да ги прави неразтворими, но без всъщност да ги денатурира.

Метанолът е най-използваният реагент за фиксиране на намазка във всички лаборатории, тъй като осигурява по-добри резултати от етанола. Идеалната концентрация е 99%.

заглушител

Буферът (буфериран разтвор) има функцията да регулира или поддържа рН на багрилото, тъй като pH, коригиран до 7,2, е от съществено значение за клетъчните структури да могат да абсорбират багрилата правилно.

От друга страна, етапът на фиксиране на метанол дехидратира клетките и буферът помага да ги рехидратира.

Eosin (Y)

Eosin има афинитет към градивни елементи, тъй като е кисело багрило. Известни са два вида еозин, много сходни помежду си, дотолкова, че да може да се използва един от двата, получавайки един и същ резултат.

Единият се нарича еозин Y, жълт еозин или тетрабромофлуоресцеин, а другият се нарича еозин В, синкав еритрозин В или дибромодинитрофлуоресцеин. Въпреки това, еозин Y е най-често използваният.

Най-важното свойство на това багрило е неговата отрицателна полярност, това го прави привлечен към положително заредени клетъчни структури.

Метиленово синьо

Това е основното оцветяване. Основното му свойство е метахромазията, тоест не всички структури ще бъдат оцветени в един и същи цвят, зависи от химичния състав на структурите, които се оцветяват.

Някои ще се превърнат в светло или тъмно синьо, а някои ще се превърнат в тъмно лилаво или бледо люляк.

Техника

1 -Извършете разпръскването на пробата, така че да остане тънък филм или върху пързалка или покривка.

2-Оставете да изсъхне на въздуха за около 2 часа.

3-Поставете сухата мазка върху моста за оцветяване или тава за оцветяване с разнасянето на пробата нагоре.

4-Покрийте листа с петна по Райт капка по капка, докато цялата повърхност се покрие. Оставете за 5 - 8 минути.

5-Петното трябва напълно да покрива пързалката, без да се разлива по краищата. Ако по време на оцветяването започне да се изпарява, добавете няколко допълнителни капки.

6-Впоследствие добавете равно количество амортисьор, издухайте малко, докато се появи характерният метален блясък. Време от 10 до 15 минути.

7-Измийте с чешмяна вода, като поставите нежния поток, докато листът изглежда розов.

8-С марля, напоена с алкохол, отстранете боя, залепена на гърба на пързалката.

9-Оставете намазването да изсъхне много добре, преди да поставите потапящото масло, за да го видите под микроскоп.

полезност

хематология

Той е идеален за оцветяване на петна от периферна кръв, за изследване на гъсти кръвни мазки и за изследване на клетки от проби от костен мозък.

Поради химичните свойства на тази комбинация от оцветители, клетъчните структури могат лесно да бъдат разпознати и различните видове клетки могат да бъдат разграничени.

Хрема

Тази техника е много полезна за идентифициране на клетките на назалния секрет (епителни клетки, сегментирани еозинофили, полиморфноядрени клетки) при диагностицирането на алергичен ринит.

паразитология

В този смисъл е било полезно за изследване на Leishmania sp в хистиоцитите на подкожната клетъчна тъкан при кожни язви. По същия начин се използва за идентифициране на левкоцити в пробите на изпражненията (фекална левкограма).

В този случай е от интерес за лекаря да знае дали левкоцитозата, налична в изпражненията, е полиморфонуклеарна или моноядрена. Тази констатация във фекалната левкограма ще насочи дали съответно е бактериална или вирусна инфекция.

От друга страна, паразитите, циркулиращи в кръвта, могат да бъдат намерени в еритроцита или свободни в плазмата. Търсените паразити са Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii и filarias, а във ветеринарната медицина е полезен при търсенето на Theileria equi и Babesia caballi, причинители на бебезиозата, особено при конете.

Петното от Райт и също така петна от Giemsa правят възможно разграничаването на хемопаразитите от нормалните клетъчни компоненти. За това могат да се използват два вида спредове:

Разстелете тънко

Кръвта се разпространява като тънък филм върху пързалка. Той е оцветен с петно на Райт, разкривайки характеристиките на ядрото и цитоплазмата.

Гъста капка

Тази методология се използва за изследване на наличието на паразити в по-голямо количество кръв.

За да направите това, върху слайд се поставя голяма капка кръв. Веднъж там, той трябва да бъде дефибрилиран, като прави по-големи и по-големи кръгове от центъра навън, използвайки ръба на друг слайд.

Накрая, за да можем да наблюдаваме паразитите в гъстата мазка, еритроцитите трябва да се лизират с вода.

Дихателни инфекции

На дихателно ниво тази техника също е полезна, тъй като клетките, присъстващи в пробите от храчки, бронхиални промивки или бронхоалвеоларни, са важни за установяване на диагнозата.

По подобен начин тук могат да се разграничат полиморфонуклеарни клетки и мононуклеарни клетки.

бактериология

Използването на тази техника в бактериологията е ограничено, тъй като не е добре за оцветяване на бактерии, поради което за оцветяването им се използват други специализирани техники за оцветяване.

Въпреки това, той е бил използван за търсене на епителни клетки с тела за включване на Chlamydia trachomatis в намазките на уретралната или ендоцервикалната лигавица, въпреки че трябва да се признае, че това не е най-добрият метод за това.

Възможно е също да се наблюдават спираловидни бактерии като Borrelia burgdorferi сред червените кръвни клетки при заразени пациенти, както и морули или тела за включване на Ehrlichia sp в цитоплазмата на лимфоцити, моноцити или неутрофили в кръвен маз.

микология

Хистоплазма капсулатум е патогенна гъбичка, често диагностицирана чрез микроскопично наблюдение на различни тъканни проби, оцветени с петно на Райт.

Как се наблюдават структурите на кръвната проба с петното на Райт?

Източник: Retamales E, Mazo V. Институт за обществено здраве, правителство на Чили. Препоръки за оцветяване на кръвни мазки за четене на хемограмата.

Препоръки за добро оцветяване

Плъзгащите проби от кръв трябва да изсъхнат спонтанно. Мазните трябва да са възможно най-тънки, за да се постигне по-добро фиксиране на багрилото и да се избягва прекомерното оцветяване.

За висококачествено оцветяване е препоръчително да се оцветят в рамките на два часа след приготвяне на намазка. От друга страна, идеалната проба е капилярна кръв, без антикоагулант.

Ако обаче се използва венозна кръв, тя трябва да се използва като антикоагулант EDTA, а не хепарин, тъй като последната може да деформира клетъчните структури.

За да се избегне влошаване на подготвения оцветител, той трябва да се съхранява на сухи места.

По време на процеса на измиване се препоръчва използването на вода, регулирана до неутрално pH.

И накрая, препоръчително е от време на време да се тестват методите за оцветяване, използвани в лабораторията.

Това става чрез оцветяване на проби или разширени шарки, като контрол на качеството. Тази стъпка е важна, тъй като гарантира, че оцветяването е правилно подготвено и времената на оцветяване са добре стандартизирани.

Ако листът с шаблон е слабо оцветен, тогава има проблеми, които трябва да бъдат решени.

Чести грешки при оцветяването на Райт

Много бледо оцветяване

Много бледите намазки обикновено се дължат на много кратко време на оцветяване или прекомерно измиване. Той се коригира чрез удължаване на времето за контакт с багрилото или намаляване на времето за измиване.

Оцветители се утаяват

Наличието на утайки от багрила в намазката може да има няколко причини, но най-честите причини са: използване на нефилтрирано багрило, оцветяване върху неравномерни оцветяващи мостове, използване на листа, замърсени с прах или мазнини, не измиване добре пълно оцветяване

Изключително червен или син намазка

Буферът е отговорен за рН на багрилото. Багрилата с pH под посоченото (киселинно) ще доведат до много червеникави петна.

Ако pH на багрилото е по-високо (алкално), ще се получи изключително синкав намазка.

Режим на съхранение

Реагентът трябва да се съхранява при стайна температура.

Препратки

Gutiérrez V. Сравнително проучване между метода на оцветяване на Райт и теста Elisa за диагностика на кучешката ерлихиоза в град Сан Педро Сула, Хондурас. 2008. Дисертация за придобиване на право за ветеринарномедицинска степен. Университет на Сан Карлос от Гватемала.
López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Основни петна в лабораторията по микробиология. Изследвания в областта на уврежданията. 2014; 3 (1): 10-18.
"Райт петно." Уикипедия, Свободната енциклопедия. 18 май 2018 г., 12:05 UTC. 8 Дек 2018, 20:37
Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Честота на Babesia spp. при лов на коне, Кордова (Колумбия). Преподобна удкаактивен разгласяващ. 2013; 16 (2): 451-458.
Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Микробиологична диагностика на Бейли и Скот. 12 изд. Аржентина. Редакция Panamericana SA
Retamales E, Mazo V. Институт на правителството за обществено здраве на Чили. Препоръки за оцветяване на кръвни мазки за четене на хемограмата.

ОЦВЕТЯВАНЕ НА РАЙТ: ОБОСНОВКА, МАТЕРИАЛИ, ТЕХНИКА И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЯ - 2025