ПЕТНА ПО ZIEHL-NEELSEN: ОБОСНОВКА, РЕАКТИВИ И ТЕХНИКА - БИОЛОГИЯ - 2025

В Ziehl-Neelsen оцветител техника за идентифициране на микроорганизми устойчива на алкохол киселина (ARA). Името на тази микробиологична процедура се отнася до нейните автори: бактериологът Франц Циел и патологът Фридрих Нелсен.

Тази техника е вид диференциално оцветяване, което предполага използването на различни багрила, за да се създаде контраст между структурите, които искате да наблюдавате, диференцирате и по-късно идентифицирате. Петното Ziehl-Neelsen се използва за идентифициране на някои видове микроорганизми.

Петно Ziehl-Neelsen

Някои от тези организми са микобактерии (напр. Mycobacterium tuberculosis), нокардия (напр. Nocardia sp.) И някои едноклетъчни паразити (напр. Cryptosporidium parvum). Много от бактериите могат да бъдат класифицирани чрез обща техника, наречена петно ​​по Грам.

Някои бактериални групи обаче изискват други методи, за да могат да ги идентифицират. Техники като оцветяването на Ziehl-Neelsen изискват комбинации от багрила с топлина, за да фиксират предишното към клетъчната стена.

След това идва процес на избелване, който дава възможност за два резултата: устойчивост или чувствителност към промяна в цвета на киселини и алкохоли.

основа

Обосновката на тази техника за оцветяване се основава на свойствата на клетъчната стена на тези микроорганизми. Стената е изградена от вид мастни киселини, наречени миколови киселини; Те се характеризират с това, че имат много дълги вериги.

Когато мастните киселини имат много дълги структури, те могат да задържат багрилата по-лесно. Някои бактериални родове са много трудни за оцветяване чрез оцветяване по Грам, поради високото съдържание на миколови киселини в клетъчната стена.

Петното Ziehl-Neelsen използва фенолното съединение карбол фуксин, основно петно. Това има способността да взаимодейства с мастните киселини на клетъчната стена, която има восъчна текстура при стайна температура.

Оцветяването с карбол фуксин се засилва при наличие на топлина, тъй като восъкът се топи и молекулите на багрилото се придвижват по-бързо в клетъчната стена.

Киселината, която се използва по-късно, служи за обезцветяване на клетки, които не са били оцветени, тъй като стената им не е била достатъчно свързана с багрилото; следователно, силата на киселият белина е в състояние да премахне киселото багрило. Клетките, които устояват на тази промяна в цвета, се наричат ​​бързо киселинни.

Вторичен оцветител

След обезцветяване на пробата, тя се контрастира с друго багрило, наречено вторично багрило. Обикновено се използва метиленово синьо или малахитово зелено.

Вторичното багрило оцветява фоновия материал и следователно създава контраст с структурите, които са били оцветени в първия етап. Само обезцветените клетки абсорбират второто багрило (противоположно) и поемат цвета си, докато киселинно бързите клетки запазват червения си цвят.

Тази процедура често се използва за идентифициране на Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium leprae, които се наричат ​​бързо киселинни бацили.

Реагенти

Основен оцветител

Използва се 0,3% карболов фуксин (филтриран). Това багрило се приготвя от смес от алкохоли: фенол в етанол (90%) или метанол (95%), като в тази смес се разтварят 3 грама основен фуксин.

Избелващ разтвор

В този етап могат да се използват разтвори на 3% алкохолна киселина или 25% сярна киселина.

Вторично багрило (противоцветно)

Багрилото, което най-често се използва за контрастиране на пробите, обикновено е 0,3% метиленово синьо. Въпреки това могат да се използват и други, като например 0,5% малахитово зелено.

Техника

Киселинно бързо оцветяване

Пригответе бактериална намазка

Тази подготовка се извършва на чист, сух слайд, като се спазват предпазните мерки за стерилност.

Изсушаване на намазка

Оставете намазката да изсъхне при стайна температура.

Загрейте пробата

Пробата трябва да се нагрее чрез подаване на огън върху слайда отдолу. Фиксирането на алкохол може да се извърши, когато намазката не е подготвена със храчка (обработена с натриев хипохлорит, за да я избели) и ако няма да се оцвети веднага.

М. туберкулозата се отстранява с белина и по време на процеса на оцветяване. Топлинното фиксиране на нелекуваната храчка няма да убие М. tuberculosis, докато фиксирането на алкохол е бактерицидно.

Покрийте петното

Петното е покрито с карболния разтвор на фуксин (първично основно петно).

Загрейте петното

Това се прави за 5 минути. Трябва да забележите отделяне на пара (приблизително 60 ° C). Важно е да не се прегрява и да не се изгаря пробата.

По отношение на загряването на петното трябва да се внимава много при нагряването на карбол фуксина, особено ако оцветяването се извършва върху поднос или друг контейнер, в който са събрани силно запалими химикали от предишното оцветяване.

Под слайдовете трябва да се постави само малък пламък, като се използва предварително запален тампон, навлажнен с няколко капки кисел алкохол, метанол или 70% етанол. Избягвайте използването на голям тампон, напоен с етанол, тъй като това е опасност от пожар.

Измийте петното

Това измиване трябва да се извърши с чиста вода. Ако водата от чешмата не е чиста, измийте намазка с филтрирана или дестилирана вода, за предпочитане.

Покрийте намазката с кисел алкохол

Този киселинен алкохол трябва да бъде на 3%. Покриването се извършва в продължение на 5 минути или докато намазката не бъде достатъчно обезцветена, т.е. бледо розово на цвят.

Трябва да се има предвид, че киселият алкохол е запалим; следователно, трябва да се използва с голямо внимание. Избягвайте да сте в близост до източници на запалване.

Измийте петното

Измиването трябва да бъде с чиста дестилирана вода.

Покрийте намазката с петно

Може да бъде оцветено от малахитово зелено (0,5%) или метиленово синьо (0,3%) за 1 до 2 минути, като се използва по-дългото време, ако намазката е тънка.

Измийте петното

Отново трябва да се използва чиста (дестилирана) вода.

Да източа

Гърбът на слайда трябва да се почисти, а петното да се постави върху дренажен багажник, за да може да изсъхне на въздух (не използвайте абсорбираща хартия за сушене).

Изследвайте намазката под микроскоп

Трябва да се използва 100X обективно и потапящо масло. Сканирайте намазката систематично и запишете съответните наблюдения.

Интерпретирайте резултатите

Теоретично микроорганизмите, които оцветяват червеникав цвят, се считат за киселинно-позитивни (AAR +).

Напротив, ако микроорганизмите се оцветят в синьо или зелено, в зависимост от багрилото, използвано като контрабагрило, те се считат за киселинно-бързо отрицателни (AAR-).

Препратки

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Основи на практическата микробиология (1-во издание). Медицински издатели на братя Джейпи.
2. Бауман, Р. (2014). Микробиология с болести по телесна система (4-то изд.). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Уводна микробиология (1-во издание). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Лабораторно ръководство и работна тетрадка по микробиология: Приложения към грижи за пациентите (11 изд.). Образование McGraw-Hill.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Учебник по микробиология (1-во издание). Публикации на BI PVT.