БАКТЕРИАЛНА НАМАЗКА: ХАРАКТЕРИСТИКИ И ПОДГОТОВКА - БИОЛОГИЯ - 2024

В бактериални намазка е тънък филм намазка на суспензия на бактериални микроорганизми, която е направена от прозрачна стъклена плоча или слайд, за наблюдение под светлинен микроскоп.

Удължаването под формата на филм се извършва с цел да се разделят максимално микроорганизмите, тъй като ако те са групирани, наблюдението не е ясно.

Фигура 1. Бактериален намаз, наблюдаван под сканиращ електронен микроскоп. Източник: pixbay.com

При изучаването на бактериални култури се използват техники за приготвяне на мазка, фиксация и оцветяване, за да се анализира по-добре. Поради малкия размер на микроорганизмите, използването на оптичен микроскоп е задължително необходимо за тяхното наблюдение.

Оптичните микроскопи са основни инструменти за наблюдение на намазки. Те използват оптични лещи и светлина, позволяващи гледането на пробите с голямо увеличение.

По принцип живите клетки нямат предимно оцветени структури, виждайки се със светлинния микроскоп, те са безцветни, прозрачни проби и показват много малък вътрешен контраст и със средата си.

Наблюдението с простия светлинен полев микроскоп без използване на спомагателни техники за оцветяване е много ограничено и се използва само в някои случаи, например при наблюдение на движението на микроорганизмите.

За оптимално наблюдение на микроорганизмите трябва да се постигне баланс между контраст и разделителна способност. Детайлите на клетките не могат да се видят под микроскоп, дори и с висока разделителна способност; Използването на багрила се изисква чрез техники за оцветяване, които осигуряват контраст за наблюдение.

Характеристики на качествено бактериално намазване

Отличен контраст

За постигане на отличен контраст има сложни микроскопи, наречени фазово-контрастни микроскопи, диференциални интерференционни микроскопи и тъмни полеви микроскопи. Този тип микроскоп се използва за наблюдение на бактериални структури като обвивки и нишки, наред с други.

Оцветяването е проста техника за увеличаване на контраста, която се постига с ярък полев микроскоп. При тази техника могат да се използват различни петна, които значително подобряват микроскопичното наблюдение.

Петната се извършват директно върху намазките или разширенията на суспензиите от микроорганизми върху пързалките, предварително изсушени и фиксирани.

Добър поправка

Фиксирането е техника, използвана за запазване на клетъчните структури; причинява инактивиране на микроорганизми и адхезия към стъклото на пързалката. Има различни методи за фиксиране: топлинна фиксация и химическа фиксация.

Топлинна фиксация

Това е най-широко използваният метод за наблюдение на бактериални намазки. Техниката се състои в преминаване на бактериалната суспензия на намазка през пламъка на запалка. Тази техника е в състояние да запази външната морфология на бактериите, но унищожава вътрешните им структури.

Химична фиксация

При химическото фиксиране се използват химикали за консервиране, като формалдехид или формалин, етанол и оцетна киселина. Предимството на използването на химически фиксиращи средства е, че се постига запазване на вътрешните клетъчни структури на микроорганизмите.

Фигура 2. Намазване на кръвта. Източник: Bobjgalindo, от Wikimedia Commons

Добро оцветяване

Най-често срещаните процедури за оцветяване на предварително изсушен и фиксиран разтвор са положително или просто оцветяване, диференциално оцветяване и отрицателно оцветяване. Съществуват и специални техники за оцветяване на определени клетъчни структури (капсула, спори, жлези).

Положително оцветяване или просто оцветяване

Положителното или просто оцветяване е най-широко използваната техника за оцветяване на намазка. Той използва багрила, които имат способността да се свързват с определени микробни структури, позволявайки им да се наблюдават под микроскоп.

Тези багрила имат хромофорни групи (оцветена част) в своята химическа структура, с редуващи се двойни връзки и единични връзки (конюгиране). Тези връзки от своя страна могат да установят йонни или ковалентни връзки с някои клетъчни структури.

Багрилата, използвани при положително или просто оцветяване, са предимно химични производни на анилин (цветни органични соли).

От друга страна, сред багрилата можем да намерим някои с основно рН, а други с киселинно рН.

Основни оцветители

В основните багрила хромофорната група има положителен електрически заряд. По-голямата част от прокариотните микроорганизми имат неутрално вътрешно pH и тяхната клетъчна повърхност е отрицателно заредена. Чрез това електростатично взаимодействие хромофорът се свързва с клетката и я оцветява.

Примери за основни багрила са метиленово синьо, кристално виолетово, малахитово зелено, основен фусцин, сафранин, между другото.

Кисели бои

В кисели багрила хромофорната група има отрицателен електрически заряд. Те се използват за оцветяване на протеини с положително заредени амино групи. Примери за кисели багрила са киселият фусцин, розовата бенгалка, конго червеното и еозина.

Диференциално оцветяване

Техниката за диференциално оцветяване се състои в нанасяне на две багрила с различен цвят или интензитет, за да се разграничат различни микроорганизми под микроскопа. Петното по Грам и петна от киселинно-алкохолна устойчивост са най-често използваните диференциални петна в бактериологията.

Петното по Грам се използва като предварителен тест за познаване на формата, размера, групирането на клетките, както и вида на клетъчната стена. Използвайки теста за оцветяване по Грам, бактериите на клетъчната стена се класифицират в грам положителни бактерии и грам отрицателни бактерии.

Отрицателно оцветяване

При тази техника се използват химически оцветители, които не проникват във вътрешността на клетката, но правят средата, в която микроорганизмите се появяват като черен фон.

При техниката на отрицателно оцветяване намазката се прави с капка мастило от Индия или суспензия от нигрозин, която след като се изсуши при стайна температура, образува непрозрачен филм за преминаване на светлината. По този начин микроорганизмите се появяват като ярки форми на тъмен фон.

подготовка

А. Размазване

1.- Измийте слайдовете много добре, подсушете с абсорбираща хартия и ги етикетирайте. Етикетът трябва да посочва съдържанието на препарата, датата и името на лицето, което го е обработило.

2.- Запалете запалката и стерилизирайте примката за инокулация в пламъка до яркочервено.

3.- Оставете дръжката да се охлади.

4.- Вземете епруветката с бактериална култура, свалете капачката и бързо преминете устата на епруветката близо до пламъка на горелката (пламък).

5.- Поставете инокулационния контур в епруветката с бактериална култура и вземете пробата.

6.- Ако културата е в течна среда, поставете пробата, взета с дръжката, в центъра на пързалката и я разстелете внимателно в кръг с диаметър приблизително 2 cm.

7.- Стерилизирайте отново примката за инокулация.

8.- Оставете намазката да изсъхне на въздуха.

9.- Повторете стъпки 3 до 8 три пъти.

10.- Ако културата е в твърда среда, капка дестилирана вода трябва предварително да се постави върху пързалката. Това се прави за смесване на малка проба от културата, взета с веригата за инокулация, както е указано в стъпки 2 до 5 (асептични условия).

11.- Разтворете разредената проба с капката вода върху пързалката и повторете три пъти.

Б. Фиксиране

1.- Добавете две капки метанол или абсолютен етанол към сухите мазки - от култури в течна среда -.

2.- Оставете въздуха да изсъхне далеч от запалката.

3.- Ако намазката идва от култура в твърда среда, сухият размазване се фиксира с топлина, преминавайки го 2 до 3 пъти бързо през най-горещата част на по-лекия пламък.

4.- Докоснете долната част на намазката с дорзалната част на лявата ръка (за десничари; в противен случай използвайте дясната ръка) и проверете дали е студена.

В. Просто оцветяване

1.- Добавете 2 капки от избраното петно ​​към намазката и оставете да действа за времето, необходимо в специфичните протоколи за всяко петно ​​(обикновено между 1 и 5 минути).

2.- Някои петна изискват използването на топлина за тяхното активиране, като в този случай е необходимо да бъдете много внимателни при нагряване на слайда в по-лекия пламък (манипулирайте го с пинсети и избягвайте да заври). Прегряването на намазката може да унищожи клетките, които трябва да се наблюдават.

3.- Премахнете излишния оцветител чрез измиване с дестилирана вода от пикет. Извадете водата за измиване, като леко докоснете пързалката по ръба й, наклонен върху работната маса.

4.- Позволете изсушаване на въздуха.

5.- В зависимост от вида на наблюдението, на този етап се използва капак или не. Покривката предпазва и запазва намазката. Ако на този етап се направи наблюдение на потапяне на масло, не се използват покривни покривки, но намазката не може да се запази.

Г. окончателно запазване на намазката

1.- Потопете намазката последователно във всеки от посочените по-долу разтвори за минимум 5 минути. Целта на тези „бани“ е да дехидратират напълно намазката. Всеки реагент трябва да бъде добре изцеден, преди да се нанесе намазка в следващата баня.

Редът на дехидратиращите бани е следният:

1. Етанол 70%
2. Етанол 95%
3. Чист ацетон
4. Ацетон -ксилол 1: 1 смес
5. Ксилол

След това оставете да изсъхне на въздух.

2. - Монтирайте покривалото, за предпочитане 22 × 22 мм, като използвате балсам от Канада или друга монтажна среда.

Препратки

1. Бригс, Г. (1965). Причинни фактори при микробиологични лабораторни аварии и инфекции. Биологични лаборатории на армията на САЩ. Форт Детрик.
2. Cappucino, JG и Welch, CT (2017). Микробиология: лабораторно ръководство. Пиърсън.
3. Холт, JG редактор. (1977). По-краткото ръководство на Бергей по решаваща бактериология. 8 ^-ми Балтимор: Уилямс и Уилкинс Ко
4. Johnson, TR и Case; CL (2018). Лабораторни експерименти в микробиологията. Пиърсън.
5. Тил, П. (2017). Диагностична микробиология. 14 ^-ти Сейнт Луис, САЩ: Elsiever, Inc.