ПЕТНА ОТ GIEMSA: ОБОСНОВКА, МАТЕРИАЛИ, ТЕХНИКА И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЯ - 2025

Петното от Giemsa е вид оцветяващи клинични проби, базирани на сместа от киселини и основни багрила. Създаването му е вдъхновено от работата, извършена от Романовски, където Густав Гимса, химик и бактериолог с произход от Германия, го усъвършенства, като добавя глицерол за стабилизиране на съединенията.

Промените, генерирани в оригиналната техника на Романовски, позволиха значително да подобрят микроскопичните наблюдения, поради което техниката беше кръстена с името на петно ​​от Giemsa.

Различни проби, оцветени с петно ​​от Giemsa. А. Trypanosoma evansi в периферна кръв. Б. Нормални кръвни клетки. В. Borrelia theileri в периферна кръв. Лимфом на Д. Бъркит.

Тъй като това е проста техника за изпълнение, високо функционална и икономична, понастоящем се използва широко в клиничната лаборатория за хематологични намазки, проби от костен мозък и тъкани.

Техниката за оцветяване на Giemsa е много полезна за цитологични изследвания, тъй като позволява наблюдението на специфични клетъчни структури. Тази техника оцветява цитоплазмите, ядрата, нуклеолите, вакуолите и гранулите на клетките, като е в състояние да различи дори фините следи от хроматин.

Освен това могат да бъдат открити значителни промени в размера, формата или оцветяването на ядрото, където е възможно да се визуализира загубата на връзката ядро-цитоплазма.

От друга страна, тя позволява да се идентифицират незрели клетки в костния мозък и периферната кръв, като са важни за диагностицирането на сериозни заболявания като левкемия. Възможно е също така да се открият хемопаразити, допълнителни и вътреклетъчни бактерии, гъбички.

В цитогенетиката той се използва широко, тъй като е възможно да се изследва митозата на клетките.

Основа на оцветяването на Giemsa

Боите от тип Romanowsky се основават на използването на контраст между кисели и основни багрила, за да се постигне оцветяване съответно на основните и киселинни структури. Както се вижда, има афинитет на кисели багрила за оцветяване на основни структури и обратно.

Основното използвано багрило е метиленово синьо и неговите окислени производни (Azure A и Azure B), докато киселото багрило е еозин.

Киселинните структури на клетките са нуклеиновите киселини, гранулите на сегментираните базофили, между другото, следователно те ще бъдат оцветени с метиленово синьо.

В този същия смисъл основните структури на клетките са хемоглобин и някои гранули като тези, които се съдържат в сегментирани еозинофили, наред с други; те ще бъдат оцветени с еозин.

От друга страна, поради факта, че метиленово синьото и лазурното се характеризират с това, че са метахроматични оцветители, те могат да осигурят променлив оттенък на различните структури в зависимост от натоварването на полианиони, които притежават.

Ето как стратегическата комбинация от основни и кисели багрила успява да развие широк спектър от цветове, според биохимичните характеристики на всяка структура, преминавайки през бледосин, тъмносин, люляк и лилав оттенък в случай на киселинни структури.

Докато оцветяването, осигурено от еозин, е по-стабилно, генерира цветове между червеникаво-оранжево и сьомга.

материали

Материали за приготвяне на основния разтвор

Приготвянето на основния разтвор изисква претегляне на 600 mg прахово петно ​​Giemsa, измерване на 500 cc метилов алкохол без ацетон и 50 cc неутрален глицерин.

Как да приготвим основния разтвор

Поставете тежкия прах Giemsa в хаванче. Ако има бучки, те трябва да се напръскат. Впоследствие добавете значително количество от измерения глицерин и разбъркайте много добре. Получената смес се изсипва в много чиста кехлибарена бутилка.

Останалата част от глицерина се поставя в хоросана. Разбъркайте отново, за да почистите останалата част от оцветителя, който се е залепил по стените на хоросана и добавете към същия буркан.

Бутилката се затваря и се поставя във водна баня при 55 ° С за 2 часа. Докато е на водна баня, внимателно разклащайте сместа на всеки половин час.

Впоследствие сместа се оставя да се охлади, за да се постави алкохола. Преди това част от измерения алкохол се поставя в хоросана, за да завърши измиването на останалия оцветител и след това се добавя към сместа заедно с останалия алкохол.

Този препарат трябва да се остави да отлежава поне 2 седмици. Използваната част от основния разтвор трябва да се филтрира.

За да се избегне замърсяване на препарата, се препоръчва да прехвърлите порцията, която ще бъде в постоянна употреба, в малка кехлибарена бутилка с капкомер. Допълвайте всеки път, когато реагентът изтече.

Материали за приготвяне на буферния разтвор

От друга страна, буферен разтвор при рН 7,2 се приготвя, както следва:

6.77 g натриев фосфат (безводен) (NaHPO ₄), 2.59 g калиев дихидроген фосфат (KH ₂ PO ₄) и дестилирана вода се претеглят до 1000 cc.

Крайна подготовка на оцветителя

За приготвянето на крайния разтвор за оцветяване се измерват 2 ml от филтрирания основен разтвор и се смесват с 6 ml от буферния разтвор. Разбъркайте сместа.

Релевантен факт, който трябва да се вземе предвид, е, че техниките за подготовка на оцветителите могат да се променят в зависимост от търговския дом.

Допълнителни материали, необходими за извършване на оцветяването

Освен описаните материали, трябва да имате мостове за оцветяване, тениски с вода или буфер за измиване, предметни пързалки или капаци за предмети, хронометър за контрол на времето за оцветяване и петна от хартия или някакъв материал, който може да се използва за изсушаване (марля или памук).

Техника

Процес на оцветяване

1) Преди оцветяване, намазването на пробата трябва да е готово върху чиста пързалка.

Пробите могат да бъдат кръв, костен мозък, хистологични тъканни участъци или цервико-вагинални проби. Препоръчва се намазването да е тънко и да има 1 или 2 часа сушене преди оцветяване.

2) На моста за оцветяване поставете всички листове, които трябва да бъдат оцветени. Винаги работите в един и същ ред и всеки лист е добре идентифициран.

3) Поставете няколко капки 100% метилов алкохол (метанол) върху намазката и оставете да действа 3 до 5 минути, за да фиксира и дехидратира пробата.

4) Изхвърлете метанола в листа и оставете да изсъхне на въздух.

5) След като изсъхне, поставете окончателния разтвор за оцветяване с капкомер, докато целият лист се покрие. Оставете да действа за 15 минути. Някои автори препоръчват до 25 минути. Зависи от бизнес къщата.

6) Изцедете петното и измийте намаза с дестилирана вода или с 7,2 буферен разтвор.

7) На попивателна хартия оставете листата да изсъхнат на открито, подредени вертикално с помощта на опора.

8) Почистете гърба на слайда с тампон със спирт или памучен тампон, за да премахнете следи от петна.

комунални услуги

Техниката за оцветяване на Giemsa се използва в различни области, сред които: хематология, микология, бактериология, паразитология, цитология и цитогенетика.

хематология

Това е най-честата употреба, която се дава на това петно. С него могат да бъдат идентифицирани всяка една от клетките, присъстващи в проби от костен мозък или периферна кръв. Както и оценка на броя на всяка серия, възможност за откриване на левкоцитоза или левкопения, тромбоцитопения и др.

Тъй като е чувствителен при идентифициране на незрели клетки, той е от значение при диагностицирането на остри или хронични левкемии. Възможно е също така да се постави диагнозата анемия, като сърповидноклетъчна анемия, сърповидна клетка и др.

микология

В тази област употребата му е обичайна за търсене на Histoplasma capsulatum (вътреклетъчна диморфна гъба) в тъканни проби.

бактериология

При хематологични намазки, оцветени с Giemsa, е възможно да се открие Borrelias sp при пациенти, които представят с болестта, наречена повтаряща се треска. Спирохетите са в изобилие сред еритроцитите, в проби, взети в пика на треската.

Възможно е също да се визуализират вътреклетъчните бактерии като Rickettsia sp и Chlamydia trachomatis в заразени клетки.

паразитология

В областта на паразитологията оцветяването на Giemsa даде възможност за диагностициране на паразитни заболявания като малария, болест на Chagas и лайшманиоза.

В първите два паразита съответно Plasmodium sp и Trypanosoma cruzi могат да се видят в периферната кръв на заразените пациенти, те могат да бъдат открити в различни етапи в зависимост от фазата, в която е заболяването.

За да се подобри търсенето на паразити в кръвта, се препоръчва използването на петно ​​Giemsa, смесено с петното от май-Грюнвалд.

По същия начин, кожната лайшманиоза може да бъде диагностицирана чрез оценка на проби от кожни биопсии, оцветени с Гемса, където е открит паразитът.

цитология

Оцветяването с Giemsa се използва и за цитологично изследване на ендоцервикални проби, въпреки че не е най-често използваната техника за тази цел.

Но в случаи на недостиг на ресурси той може да се използва, като има подобна функционалност на тази, предлагана от техниката на Папаниколау и на по-ниска цена. Това обаче изисква експертиза от страна на проверяващия.

цитогенетика

Релевантна особеност на оцветяването на Giemsa е способността му да се свързва силно с богатите на аденин и тимин области на ДНК. Това позволява ДНК да се визуализира по време на клетъчната митоза, при различни състояния на кондензация.

Тези изследвания са необходими за откриване на хроматични аберации, като дублиране, делеция или транслокация на различните области на хромозомите.

Изследвания, доказващи ефикасността на петна от Giemsa

Cannova et al (2016), сравняват 3 техники за оцветяване за диагностициране на кожна лейшманиоза.

За това те използвали проби, получени от опитно животно (Mesocrisetus auratus), експериментално инокулирано с Leishmanias.

Авторите демонстрират, че петното от Giemsa е по-добро от петното от Pap-mart® и Gaffney. Ето защо те считаха, че петното от Giemsa е идеално за диагностициране на кожна лейшманиоза.

Отличните резултати, получени от авторите, се дължат на факта, че комбинацията от багрила, съставляващи сместа Giemsa, представя необходимите условия за създаване на благоприятен контраст, което позволява ясно да се разграничат структурите на амастиготи, както вътреклетъчно, така и извънклетъчно.

Останалите техники (Pap-mart® и Gaffney) също го направиха, но по-слаб и следователно по-труден за визуализиране. Ето защо петното от Giemsa се препоръчва за паразитологичната диагноза на лайшманиозата.

По същия начин, изследване на Ramírez et al (1994) оценява валидността на петна от Giemsa и Lendrum в конюнктивални мазки за идентифициране на Chlamydia trachomatis.

Авторите определят, че петна от Giemsa и Ledrum имат еднаква специфичност, но беше установено, че Giemsa е по-чувствителна.

Това обяснява защо петното от Giemsa в момента е най-често използваното за диагностициране на хламидиални инфекции, особено ако има малко ресурси.

Източник: PanReac Applicationhem ITW Reagents. Петна от Giemsa. Версия 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Испания.

Препоръки за добро оцветяване

Сушенето на листовете не трябва да се ускорява. Трябва да се очаква разумно време, за да се изсуши на открито. Приблизително 2 часа.

Оцветете веднага след 2 часа за най-добри резултати.

За да се фиксират и оцветяват по-добре, пробата трябва да се разпредели върху слайда по такъв начин, че да остане тънък и равномерен слой.

Предпочитаната кръвна проба е капилярна, тъй като намазката се прави директно от капката кръв и следователно пробата не съдържа никакви добавки, което благоприятства поддържането на клетъчните структури.

Ако обаче се използва венозна кръв, EDTA трябва да се използва като антикоагулант, а не хепарин, тъй като хепаринът обикновено деформира клетките.

Чести грешки при оцветяването на Giemsa

В практиката на това оцветяване могат да се правят грешки. Те се доказват от резки промени в тоналностите на структурите.

Изключително синьо оцветяване

Може да се дължи на:

• Много гъсти намазки
• Превишаване на времето за оцветяване
• Измийте недостатъчно.
• Използване на реагенти доста над неутрално (алкално) pH.

При тези условия цветовете на следните структури се изкривяват по такъв начин, че еритроцитите вместо оцветяване на сьомга-розово ще изглеждат зелени, гранулите на еозинофилите, които трябва да бъдат оцветени в тухлено червено, ще станат синкави или сиви и така нататък ще има отклонение в обичайните тонове.

Прекомерно розово оцветяване

Може да се дължи на:

• Недостатъчно време за оцветяване.
• Продължително или прекомерно измиване.
• Лошо изсушаване.
• Използване на силно киселинни реактиви.

В този конкретен случай структурите, които обикновено оцветяват синьо, няма да бъдат почти видими, докато структурите, които оцветяват розово, ще имат силно преувеличени нюанси.

Пример: Червените кръвни клетки ще станат яркочервени или ярко оранжеви, ядреният хроматин ще изглежда бледо розов, а гранулите от еозинофил ще оцветят наситено ярко червено.

Наличие на утайки в намазката

Причините могат да бъдат:

• Използвайте мръсни или лошо измити филми.
• Не позволявайте намазването да изсъхне добре.
• Оставянето на фиксиращото решение е твърде дълго.
• Неадекватно измиване в края на оцветяването.
• Неадекватна филтрация или липса на филтрация на използвания оцветител.

Наличие на морфологични артефакти

Морфологичните артефакти могат да се появят в намазки, което затруднява визуализирането и интерпретирането на присъстващите структури. Това се дължи на:

• Вид на използвания антикоагулант, като хепарин.
• Използване на мръсни, повредени или мазни филми.

Режим на съхранение

След приготвянето, багрилото трябва да се държи на стайна температура (15 - 25 ° C), за да не се утаи. Той трябва да се съхранява в плътно затворен контейнер с кехлибар.

Препратки

1. Cannova D, Brito E и Simons M. Оценка на оцветяващи техники за диагностициране на кожна лайшманиоза. Salus. 2016; 20 (2): 24-29.
2. PanReac Applicationhem ITW реагенти. Петна от Giemsa. Версия 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Испания.
3. Clark G. Оцветяване процедури (1981), 4thed. Уилямс и Уилкинс.
4. Приложна клинична химия. Петна от Giemsa за ин витро диагностика. Дистрибутор: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F и Grazioso C. Валидност на петна от Giemsa и Lendrum в конюнктивни мазки за идентифициране на Chlamydia trachomatis. Бол на Санит Панам. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Casas-Rincón G. Обща микология. 1994. II издание на Централния университет на Венецуела, издания на библиотеката. Каракас Венецуела.
7. "Петно от Giemsa." Уикипедия, Свободната енциклопедия. 1 септември 2017, 01:02 UTC. 6 декември 2018 г. es.wikipedia.org.