ПЕТНА ОТ ГРАМ: ОБОСНОВКА, МАТЕРИАЛИ, ТЕХНИКА И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЯ - 2025

На петното Грам е най-простият и най-полезни оцветяване техниката в диагностичен микробиология. Тази техника е създадена от датския лекар Ханс Кристиан Грам през 1884 г., който успява да класифицира бактериите като грамположителни и грам отрицателни според състава на клетъчната стена.

Техниката претърпя някои модификации от Хукер през 1921 г. за стабилизиране на реагентите и подобряване на качеството на оцветяването, поради което оцветяването по Грам е известно още като Gram-Hucker.

Различни намазки, оцветени с грам петно. А. Грам положителни коки. Б. Грам отрицателни пръчки. В. Грам-положителни, полиморфонуклеарни и мононуклеарни бацили. Г. Дрожди.

С тази техника е възможно да се наблюдава и формата на микроорганизмите, тоест, ако те са коки, бацили, кокобацили, плеоморфни, нишковидни и други. Както и разпределението му в пространството: в клъстер, във верига, изолирани, по двойки, в тетради и т.н.

Когато се подозира бактериална инфекция, повечето от получените проби трябва да бъдат намазани с пързалка и оцветени по Грам за микроскопско изследване.

Докладът за Грам ще насочи лекаря за това какъв вид микроорганизъм може да е причината за инфекцията, преди да получи окончателния резултат от културата.

В някои случаи животът на пациента е много компрометиран, поради което лекарите спешно се нуждаят от доклада на Грам, за да поставят емпирично лечение, докато чакат идентифицирането на микроорганизма.

Например, ако Грам разкрие, че в цереброспиналната течност има грам положителни коки, лекарят ще ръководи първоначалната терапия с антибиотици, които елиминират този вид бактерии, съгласно протоколите, установени за това.

След като крайният резултат пристигне с името на изолирания микроорганизъм и съответната му антибиограма, лекарят ще прецени дали да промени терапията или не. Това решение ще бъде взето според изследването на чувствителността на микроорганизма към антибиотиците, които той приема и еволюцията на пациента.

основа

Това е техника, която има 4 основни стъпки: оцветяване, фиксиране с морда, обезцветяване и контраст. Следователно тази техника, освен че оцветява бактериите, позволява и тяхното разграничаване.

Кристалната виолетка е първият използван оцветител. Той има афинитет към пептидогликана и ще оцвети всички присъстващи бактерии в лилаво, впоследствие се поставя луголът, който действа като морда, тоест ще предизвика образуването на неразтворими кристални виолетово-йодни комплекси - рибонуклеарни протеини в клетката.,

Грам-положителните бактерии, имащи плътна стена от пептидогликан, образуват по-големи комплекси (кристално виолетово-йоден), поради което задържат багрилото.

В допълнение, това също влияе, че стената на Грам положителните бактерии съдържа по-голямо количество ненаситени киселини, които показват голям афинитет към окислителите (Lugol).

Междувременно Грам-отрицателните бактерии имат тънък слой пептидогликан, което кара бактериите да образуват по-малко комплекси от Грам положителните.

След това идва стъпката на обезцветяване, при която грамоположителните и грамотрицателните бактерии се държат различно.

Грам-отрицателните бактерии съдържат външна мембрана, богата на липополизахариди, която е част от тяхната клетъчна стена. Мазнините се унищожават при контакт с ацетонов алкохол, така че външната мембрана се дестабилизира, отделяйки виолетовия кристал.

Ето как тогава се противодейства със сафранин или основен фуксин, като става червен.

В случай на грам-положителни бактерии те устояват на избледняване, тъй като белина действа, като затваря порите, предотвратявайки изтичането на кристално виолетовия / йодния комплекс.

Следователно оцветяването с кристално виолетово остава стабилно и няма място за сафранин или фуксин. Ето защо тези бактерии оцветяват наситено синьо или лилаво.

материали

Комплектът за оцветяване на Грам се състои от:

• Виолетово стъкло
• Лугол
• Ацетон алкохол
• Сафранин или основен фуксин

Приготвяне на багрила и реагенти

Кристално виолетов разтвор

Решение за:

Виолетов кристал ------------- 2 gr

Етилов алкохол 95% ----------- 20cc

Решение B:

Амониев оксалат ----------- 0,8 gr

Дестилирана вода ------------- 80 cc

За окончателното приготвяне на кристално виолетов разтвор А трябва да се разрежда 1:10 с дестилирана вода и да се смесва с 4 части разтвор Б. Сместа се съхранява за 24 часа преди употреба. Филтрирайте в бутилка за оцветяване с кехлибар с помощта на филтърна хартия.

Сумата, която трябва да се използва ежедневно, се прехвърля в бутилка за капчици с кехлибар.

Йод-Лугол

Претеглете и измерете посоченото количество на всяко съединение, както следва:

Йодни кристали ------------- 1гр

Калиев йодид ------------- 2gr

Дестилирана вода ------------- 300 cc

Калиевият йодид се разтваря малко по малко във водата и след това се добавя йодът. Разтворът се обръсва в кехлибарена бутилка.

Сумата, която ще се използва ежедневно, се прехвърля в по-малка бутилка от кехлибар с капкомер.

Избелване

95% етилов алкохол -----------– 50 мл

Ацетон ------------------ 50 мл

Приготвя се в равни части. Покрийте добре, тъй като има тенденция да се изпарява.

Поставете в бутилка за капкомер.

Този препарат осигурява обезцветяване в умерено време 5-10 секунди и е най-препоръчителен.

Начинаещите предпочитат да използват само 95% етилов алкохол, където избледняването е по-бавно от 10 до 30 сек.

Докато по-опитните могат да използват чист ацетон, където обезцветяването настъпва много бързо от 1 до 5 сек.

Контраст

Запасно решение на Safranin

Сафранина -------------– 2,5 гр

Етилов алкохол 95% --------– 100 cc

След претегляне на посоченото количество сафранин той се разтваря в 100 ml 95% етилов алкохол.

Работният разтвор на сафранин се приготвя от основния разтвор.

За да направите това, измерете 10 cc от основния разтвор, добавете 90 cc дестилирана вода, за да направите 100 ml.

Препоръчва се да прехвърляте количеството, което ще използвате ежедневно, в кехлибарена бутилка с капкомер.

Микроорганизмите, които оцветяват слабо грам-отрицателно с оцветяването по Gram-Hucker, като някои анаероби, Legionella sp, Campylobacter sp и Brucella sp, могат да бъдат оцветени много по-добре, използвайки модификацията на Kopeloff на оцветяването по Gram-Hucker, наречено петно ​​по Грам-Копелоф.

Тази техника променя багрилото сафранин на основен фуксин. С тази модификация е възможно ефективно оцветяване на гореспоменатите микроорганизми.

Съхранение на реагенти

Приготвените оцветители трябва да се съхраняват на стайна температура.

Подготовка на намазката на пробата, която трябва да бъде оцветена

Пробата трябва да съдържа най-малко 10 ⁵ микроорганизма, преди да се наблюдава наблюдение на микроорганизма в намазка. Мазните могат да бъдат направени от директната проба или от култури в твърда или течна среда.

Мазните трябва да са равномерни, добре разпределени и не прекалено гъсти, за по-добра визуализация на наличните структури.

-Грама от преки проби

Грам нецентрифугирана урина

Урината се смесва и 10 ц1 се поставят върху слайд. Наблюдението на поне една бактерия / поле за потапяне показва, че има инфекция.

Това означава, че културата ще има приблизително повече от 100 000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / mL) урина в 85% от случаите.

Този метод не е полезен при брой колонии под 100 000 CFU.

CSF Gram

CSF трябва да се центрофугира, супернатантата да се отстрани и пелетата да се разпространи върху пързалка. Тази течност е стерилна при нормални условия; наблюдението на бактерии показва инфекция.

Грам дихателни проби

Грамът на храчките, бронхиалното или бронхоалвеоларното промиване, въпреки че може да има разнообразие от микроорганизми, винаги ще ръководи диагнозата, в допълнение към това, че е полезен видът на наблюдаваните клетки.

В случай на храчки, намазката трябва да се подготви с най-гнойни части от пробата.

Грам на изпражненията

Не се препоръчва да се извършва грам върху този тип проби, тъй като той няма диагностична стойност.

-Грама от култури

Те могат да бъдат направени по два начина, един от течни култури, а другият от твърди култури.

Течни култури

От течните култури е изключително просто; Няколко печени от мътния бульон се вземат под горелката и се поставят върху чиста и суха пързалка, като правят кръгови движения от центъра към периферията, за да разпределят равномерно материала.

Оставете да изсъхне спонтанно във въздуха. След като изсъхне, материалът се фиксира към листа с топлина. За да направите това, с помощта на пинсети листът се прекарва 3 до 4 пъти през пламъка на горелката Bunsen, като внимавате да не изгорите материала.

Листът се оставя да изстине и се поставя върху моста за оцветяване.

Солидни култури

За да извършите намазване върху грам петна от твърда култура, процедирайте по следния начин:

Преди да изберете колониите за вземане, слайдът трябва да се подготви, като се поставят приблизително две капки стерилен физиологичен разтвор.

Ако оригиналната културна плоча съдържа няколко различни типа колонии, ще бъде избрана изолирана колония от всяка, която да изпълни Грама. Всяка колония ще бъде взета с платиновия контур, за да се разтвори в физиологичния разтвор, предварително поставен върху слайда.

Извършват се кръгови движения от центъра към периферията, за да се разпредели хомогенно колонията върху пързалката.

Оставете да изсъхне спонтанно във въздуха. След като изсъхне, листът се фиксира с топлина, както беше обяснено по-горе (чрез пламване на слайда с запалката), като внимавате да не изгорите материала.

Тази процедура трябва да се извършва с всеки различен тип колония. На лист хартия трябва да се отбележи редът на наблюдаваното, например:

Колония 1: Бета-хемолитична жълта колония: Грами положителни коки са наблюдавани в клъстери

Колония 2: Колоедна колония, без хемолиза: наблюдавани са грамотрицателни кокобацили.

Всеки слайд трябва да бъде етикетиран, за да знаем какво наблюдаваме.

Техника

Техниката за оцветяване по Грам е изключително лесна за изпълнение и сравнително евтина и не може да бъде пропусната в лаборатория за микробиология.

Извършва се по следния начин:

1. Фиксирайте намазката с топлина и поставете върху моста за оцветяване.
2. Покрийте пързалката напълно с кристално виолетово за 1 минута.
3. Измийте с вода Не изсушавайте
4. Покрийте листа с разтвор на лугол, оставете да действа 1 минута. Измийте с вода Не изсушавайте.
5. Избелвайте за 5-10 секунди с леко разклащане в алкохолен ацетон. Или поставете листа във вертикално положение и капнете капки от обезцветителя на повърхността, докато излишъкът от незадържано виолетово стъкло се отстрани. Не надвишавайте.
6. Измийте с вода Не изсушавайте.
7. Сменете слайда върху моста за оцветяване и покрийте за 30 секунди със сафранин (Gram-Hucker) или 1 минута с основен фуксин (Gram-Kopeloff).
8. Измийте с вода
9. Оставете да изсъхне спонтанно в изправено положение.

След като изсъхне, поставете 1 капка масло за потапяне, за да го наблюдавате под целта 100X в светлинния микроскоп.

полезност

Тази техника позволява да се разграничат морфотининтните различия на повечето бактерии.

Дрождите също се отличават с това оцветяване. Те вземат кристално виолетовото, тоест оцветяват грам положително.

От друга страна, могат да се разграничат образуващи спори грам-положителни пръчки, при които се наблюдава ясно пространство в рамките на бацила, където се е образувал ендоспорът, въпреки че спорите не оцветяват добре. Други техники като Shaeffer-Fulton се използват за оцветяване на спори.

Трябва да се отбележи, че това оцветяване не се използва за оцветяване на всички видове бактерии, тоест има случаи, при които оцветяването не работи.

В този случай могат да бъдат споменати бактерии, лишени от клетъчна стена. Например: род Mycoplasma, сферопласти, уреаплазма, L-форми и протопласти.

Освен това оцветява много лошо бактерии със стени, богати на миколови киселини, като микобактерии и вътреклетъчни бактерии като Chlamydias и Rickettsias.

Освен това е неефективен при оцветяване на повечето спирохетални бактерии.

Има бактерии от един и същи род, които могат да се наблюдават в същата проба като Gram положителен и Gram отрицателен. Когато това се случи, се нарича променливо оцветяване по Грам, което може да се дължи на промяна в хранителните вещества, температура, рН или концентрация на електролити.

Често срещани грешки

Прекомерно избелване

Преувеличаването в етапа на обезцветяване може да доведе до наблюдение на фалшиви грамо отрицателни микроорганизми.

Не чакайте достатъчно дълго време за сушене, за да добавите потапящото масло

Той може да причини Грам-положителните бактерии да оцветят грам отрицателни (фалшив грам отрицателен). Това се случва, защото в старите култури има вероятност да има мъртви или развалени бактерии и при тези условия бактериите не задържат кристалната виолетка.

Използвайте много стар разтвор на лугол:

С времето луголът губи свойствата си и цветът му избледнява. Ако се използва вече дегенерираният реагент, той няма да фиксира добре виолетовата кристала, следователно има възможност за получаване на визуализация на фалшиво грамотрицателни микроорганизми.

Син фон

Правилно обезцветеният фон ще бъде червен. Син фон показва, че обезцветяването е било недостатъчно.

Препратки

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Медицинска микробиология, 6-то издание McGraw-Hill, Ню Йорк, САЩ
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологична диагноза. (5-то изд.). Аржентина, редакция Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Микробиологична диагностика на Бейли и Скот. 12 изд. Аржентина. Редакция Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Обща микология. Втори редактор на Централния университет на Венецуела, издания на библиотеката. Каракас Венецуела.
5. "Грамаво петно." Уикипедия, Свободната енциклопедия. 4 октомври 2018 г., 23:40 UTC. 9 декември 2018, 17:11. Взета от es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Ръководство по медицинска микробиология. 2-ро издание, Венецуела: Дирекция на медиите и публикациите на университета в Карабобо.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Основни петна в лабораторията по микробиология. Изследвания в областта на уврежданията. 2014; 3 (1): 10-18.