МЮЛЕР ХИНТОНЕН АГАР: ОСНОВА, ПРЕПАРАТ И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЯ - 2025

На Mueller Hinton агар не е селективен, твърда хранителна среда се състои от инфузия месо, пептон киселина казеин, нишесте, агар и дестилирана вода. Тази среда позволява отличен микробен растеж за повечето бързорастящи бактерии.

Първоначално той е създаден от Джон Хауърд Мюлер и Джейн Хинтън, за да изолират хранително важни бактерии като Neisseria gonorrhoeae и Neisseria meningitidis. Въпреки това, поради своите характеристики, той се оказа идеален за изследване на чувствителността към антибиотици, осигуряващ надеждни и възпроизводими резултати.

Антибиограми (агар на Müeller Hinton). Източник: Д-р Греъм Биърдс от en.wikipedia

Следователно, Müeller Hinton Agar е културната среда, приета от Института за клинични и лабораторни стандарти (CLSI) и Европейския комитет за тестване на антимикробна чувствителност, за извършване на теста за чувствителност към антимикробни средства чрез дифузионния метод на Кирби и Бауер.

основа

Като неселективна хранителна среда, той е отличен за растежа на повечето патогенни бактерии.

От друга страна, простият му състав прави веществата лесно да се дифундират върху него, което е съществена характеристика за теста за чувствителност чрез дисковия дифузионен метод.

Друга негова характеристика е, че съдържа ниско количество инхибитори, което позволява да се оцени ефективно сулфонамидите, триметопримите и тетрациклините.

Трябва обаче да се има предвид, че носителят трябва да отговаря на определени условия, за да осигури правилното си функциониране, включително:

Регулирането на рН, дълбочината на агара и подходящата концентрация на тимин, тимидин, Са ⁺⁺, Mg ⁺⁺ и Zn ⁺⁺.

Трябва също да знаете, че методологията е стандартизирана и следователно всички параметри трябва да бъдат изпълнени, като например:

Концентрацията на инокулума, концентрацията и запазването на антибиотичните дискове, поставянето на подходящия брой дискове върху агара, разстоянието между един и друг диск, стратегическото поставяне на определени антибиотици, атмосферата, температурата и времето на инкубация.

подготовка

Претеглят се 37 g дехидратирана среда Müeller Hinton и се разтварят в 1 литър дестилирана вода. Загрейте средата, докато разбърквате, за да подпомогне разтварянето. Варете 1 минута.

Автоклавът се стерилизира при 121 ° С за 15 минути. Когато изваждате от автоклава, колбата трябва да се постави на водна баня при 50 ° С, за да се охлади. Изсипете 25 до 30 мл в стерилни петри с диаметър 10 см.

Плочите трябва да са със средна дебелина 4 мм (идеално), като се допуска диапазон от 3-5 мм.

Ако е желателно да се приготви кръвен агар, използвайки агел Müeller Hinton като основа, изсипете 5% стерилна и дефибринирана агнешка кръв, преди да сервирате върху чиниите.

Крайното рН на средата трябва да бъде между 7,2 до 7,4.

Инвестирайте и съхранявайте в хладилник до употреба. Оставете плаката да достигне стайна температура преди употреба.

Цветът на подготвената среда е светло бежов.

Приложения

Използва се за извършване на теста за чувствителност към антибиограма или за най-бързо развиващите се неизискващи патогени.

Ако агарът е допълнен с кръв, той се използва за провеждане на антибиограмата на взискателни микроорганизми като: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, наред с други. Използва се и за изолиране на Legionella pneumophila.

Антибиограма техника

Преди да се извърши антибиограмата, трябва да се приготви бактериален разтвор, еквивалентен на 1,5 х 10 ⁸ клетки.

За това се вземат 3 до 4 колонии от чистата култура и се суспендират в бульон от соева триптиказа или в бульон Müeller Hinton, инкубират се от 2 до 6 часа и концентрацията се регулира със стерилен физиологичен разтвор, сравнявайки го със стандарт на Mac Farland от 0.5%.

Ако те са взискателни микроорганизми, колониите могат да бъдат суспендирани директно до концентрация от 0.5% Mac Farland. Впоследствие плочата Müeller Hinton се посява с тампон, импрегниран с приготвения бактериален разтвор.

За да направите това, тампонът се потапя в разтвора и след това излишната течност се отстранява чрез притискане към стените на тръбата. Веднага след това тампонът се прекарва по цялата повърхност, като не оставя места недокоснати, след това плочата леко се завърта и отново се посява. Операцията се повтаря още 2 пъти.

Оставете да престои 10 минути и след това поставете антибиотичните дискове със стерилни щипки, оставяйки между тях разстояние от 24 мм. След като поставите всеки диск върху агара, натиснете леко всеки диск с щипци, за да се уверите, че те добре се прилепват.

След като процесът приключи, плаката се инвертира и инкубира при 35-37 ° С в аеробиоза в продължение на 16 до 18 часа. Ако това е взискателен микроорганизъм, той може да е причина за микроаерофилия и ако антибиограмата съдържа оксацилинови дискове, тя трябва да бъде прочетена след 24 часа.

За измерване на диаметъра на всеки ореол се използва линийка. Резултатите трябва да бъдат записани в мм. Впоследствие получените стойности се съпоставят с таблиците на точките на прекъсване, публикувани в текущото ръководство за CLSI.

Измерване на ореола на инхибиране. Източник: USCDCP, Pixnio.com

Отчитайте като чувствителен (S), междинен (I) или устойчив (R), според случая.

Антибиотиците се подбират според изолирания микроорганизъм и вида на инфекцията, която произвежда.

Понякога трябва да се има предвид стратегическото поставяне на антибиотици, за да се разкрият фенотипни модели на резистентност.

Стратегическо поставяне на диска върху агар Müeller Hinton

При ентеробактериите дискът с клавуланова киселина трябва да бъде поставен срещу цефалоспорини от трето и четвърто поколение. Яйцеобразно разширяване показва, че щамът е продуцент на бета-лактамази с разширен спектър (ESBL). Това означава, че пациентът не трябва да се лекува с никакви цефалоспорини.

Фенотипна експресия на производството на бета-лактамаза с разширен спектър (ESBL) в щам на Escherichia coli. Източник: Снимка, направена от автора MSc. Мариелса гил

При Staphylococcus е важно да поставите еритромицина или азитромицина пред диска с клиндамицин (D-тест).

Резистентният ореол в еритромицина и сплескването в ореола на клиндамицин показва, че щамът притежава устойчива на устойчивост клиндамицин (ICR). Това означава, че лечението с клиндамицин няма да бъде ефективно.

За търсене на индуцируеми AMP C щамове в Enterobacteriaceae и някои неферментиращи грамо отрицателни прътове, тазобактан цефтазидим, цефокситин или пиперацилин дискове са изправени срещу имипенем диск, на разстояние 27 mm.

Изравнен ореол в един от дисковете, обърнат към имипенем, показва наличието на индуцируема AMP C.

За търсене на конститутивен C-AMP, 500 µg клоксацилинов диск е изправен пред цефтазидим (30 µg) и цефотаксим (30 µg), на разстояние 25 mm. Разширен халоген във всеки от цефалоспорините показва положителност.

Клоксацилиновият диск също може да бъде заменен с 9 мм диск от филтърна хартия Whatman No. 6, импрегниран с фенил борна киселина (400 µg) с разстояние 18 mm. Тълкува се същото като предишното.

И накрая, за да се изследва производството на металобеталактази, особено при Pseudomonas aeruginosa, се използва диск, импрегниран с 10 ul етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA 750 µg) и тиогликолова киселина (SMA 300 µg), който е конфронтиран с имипенем и меропенем дискове на разстояние 15 мм.

Тестът е положителен, ако има разширение на ореолите на имипенем или меропенем към EDTA / SMA диска. Този резултат трябва да бъде потвърден чрез модифицирания тест на Hodge.

Този метод се състои в инокулиране на щам Escherichia coli ATCC 25922 върху плаката на Müeller Hinton. Имипенем диск се поставя в центъра на плочата и след това се прави ивица от диска към периферията със заподозрения щам на P. aeruginosa. До 4 щама могат да бъдат тествани на една плака.

Тестът ще бъде положителен, ако има зона на изкривяване на имипенемовия ореол около стрии.

Причини за грешни резултати

- Лошо запазените антибиотични дискове могат да предизвикат фалшива устойчивост. Например, оксацилиновият диск е много уязвим към промените в температурата.

-РН на средата под посочената (кисела) произвежда по-малки ореоли в аминогликозидите и макролидите (риск от фалшива резистентност), и по-големи ореоли в пеницилин, тетрациклин и новобиоцин (риск от фалшива чувствителност).

-Ако рН е над посоченото (алкално), описаните по-горе ефекти са обърнати.

-Медията с високи концентрации на тимин и тимидин оказва влияние, като значително намалява ореолите на инхибиране на сулфонамиди и триметоприм.

-Високите концентрации на калций и магнезий предизвикват фалшива устойчивост на аминогликозиди, полимиксин В и тетрациклини срещу щамове на Pseudomonas aeruginosa.

-Ниските концентрации на калций и магнезий предизвикват фалшива чувствителност на аминогликозиди, полимиксин В и тетрациклини срещу щамове на Pseudomonas aeruginosa.

-Наличието на цинк влияе върху резултатите от карбапенемовите дискове (имипенем, меропенем и ертапенем).

-Дебеността на средата под 3 mm ще доведе до фалшиви резултати за чувствителност, докато дебелината над 5 ще доведе до фалшива устойчивост.

-Мобилизацията на дискове в антибиограмата ще даде деформирани ореоли, тъй като изхвърлянето на антибиотици е незабавно.

- Много слабите инокули влияят на резултатите, тъй като няма да има равномерен или сливащ се растеж в агара, необходимо условие за измерване на ореолите на инхибиране, в допълнение към факта, че ореолите могат да дадат по-големи от нормалните стойности.

-Преднатоварената инокула може да даде ореоли по-малки от нормалното.

-Неспазването на разстоянието между дисковете прави един ореол припокриване с друг и те не могат да бъдат разчетени правилно.

-Инкубирането с CO ₂ увеличава размера на ореолите на тетрациклиновите и метицилиновите дискове.

-Инкубирането при температура под 35 ° C произвежда по-големи ореоли.

-Добавянето на кръв намалява размера на сулфатния ореол.

ограничаване

Чувствителността на антибиотик, демонстрирана в антибиограмата срещу микроорганизъм (in vitro), не е гаранция, че той ще работи in vivo.

QA

За да се знае дали средата съдържа адекватното количество тимин, трябва да се засади щам на Enterococcus faecalis ATCC 29212 и трябва да се изпита чувствителността към триметоприм сулфаметоксазол (SXT), той трябва да даде ореол равен или> 20 mm, за да бъде задоволителен.

Препратки

1. "Агар Мюлер-Хинтън." Уикипедия, Свободната енциклопедия. 16 ноември 2018 г., 12:23 UTC. 27 януари 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Микробиологична диагностика на Бейли и Скот. 12 изд. Редакция Panamericana SA Аржентина.
3. Кона Е. Условия за добро изследване на чувствителност чрез тест за дифузия на агар. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratory. Мюлер Hinton агар с 5% овча кръв. 2009.Достъпна на:
5. BD Müeller Hinton II Agar Laboratory. 2017.На разположение на:.bd.com
6. Britannia Laboratories. Мюлер Hinton агар. 2015.Наличен на: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологична диагноза. 5-то изд. Редакция Panamericana SA Аржентина.
8. Martínez-Rojas D. Беталактамази от тип AmpC: Общи положения и методи за фенотипно откриване. Преподобни Вен. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Достъпно на: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fhenotypic откриване на металобеталактази в клинични изолати на Pseudomonas aeruginosa. Касмера, 2012; 40 (2): 113-121. Достъпно на: scielo.org.