БИУРЕТ: ОБОСНОВКА, РЕАКТИВИ, ПРОЦЕДУРА, УПОТРЕБИ - БИОЛОГИЯ - 2025

На биурет е реагент, използван за определяне на протеини с дълга верига и къса верига. Той се използва особено в областта на аналитичната химия и изследване на урината за изследване на концентрацията на общите протеини в серума, плазмата и урината.

Стойностите на протеина могат да бъдат увеличени или намалени при определени патологии. Симптомите на хипопротеинемия обикновено се появяват при пациенти с бъбречни заболявания, при недохранени пациенти и при пациенти с хронични инфекции.

Химична структура на комплекса, образуван при биуретовия тест с положителна реакция на Биурет. Източник: Yikrazuul / flickr

Докато хиперпротеинемията се наблюдава при патологии като множествен миелом, системен лупус еритематозус, бактериален ендокардит, бактериален менингит, макроглобулинемия на Waldenstrom, наред с други.

От друга страна, наличието на протеин в урината се дължи на филтрацията на албумин от бъбрека. Това е патологично поведение, което трябва да се изучава.

В този смисъл биуретът е много полезен, тъй като позволява количествено да се определи наличието на протеини в серума, плазмата, урината, сред много други проби.

Дори Biuret може да се използва за изследване на присъствието и концентрацията на протеини в слабо проучени проби или проби с неизвестен състав. Следователно той е широко използван в областта на изследванията.

Тестът на Биурет се основава на откриване на пептидни връзки. Тестът се провежда в алкална среда. Пробата трябва да съдържа най-малко две пептидни връзки, за да се образува виолетово-лилав комплекс. Комплексът се образува от съединението на връзките и медния йон.

основа

Биуретовият реагент се състои от калиев хидроксид, меден сулфат и натриев и калиев тартарат. Натриевият хидроксид се използва за алкализиране на средата, тъй като това условие е от съществено значение за протичането на реакцията.

Веществата, които реагират с протеини, е куприков сулфат, докато натриевият тартарат има функцията да не позволява образуването на меден хидроксид, който има тенденция да се утаява и пречи на реакцията.

Ако в пробата се открият вещества с пептидни връзки (полипептиди или протеини), тестът ще бъде положителен.

Реакцията се интерпретира като положителна, когато разтворът стане лилав. Цветът се получава чрез образуването на комплекс между поне две пептидни връзки, които имат CO-NH групата и кубрионните катиони.

Виолетовият комплекс може да се образува по два начина: единият е чрез загубата на протони от амидните групи, които се свързват с метала (депронотация), а другият - чрез обединението на свободните и свързващи се кислородни и азотни електрони. с мед.

Тази реакция може да варира по интензитет и цвят в зависимост от вида на протеина.

Тестът може да се извърши качествено или количествено. В качествена форма той се отчита като положителен или отрицателен. Докато в количествената форма концентрацията може да бъде измерена чрез спектрофотометричния метод.

Реакцията се чете между 540-560 nm. Интензитетът на цвета е пряко пропорционален на концентрацията на пептидни връзки в пробата.

Реагенти

-20% натриев хидроксид (NaOH)

-Cupric сулфат пентахидрат 1% (CuSO _4. 5H ₂ O)

-Mixed натриев и калиев тартрат тетрахидрат (KNaC ₄ H ₄ O ₆ · 4Н ₂ O)

Стабилност на биуретовия реагент

-Трябва да се съхранява в хладилник.

процес

Техника

-Поставете 100 ul от пробата или стандарта, който ще бъде анализиран в епруветка.

-Добавете 2 ml натриев хидроксид.

-Смесете много добре.

-Добавете 5 ml биуретов реагент.

-Миксирайте и оставете да почине за 25 минути при стайна температура, покрийте и предпазете от светлина.

-Наблюдавайте образуването или не на цвят и измервайте спектрофотометрично.

Калибрационна крива

Говежди серумен албумин може да се използва като стандарт за извършване на калибровъчната крива. От него се приготвят различни концентрации. Например 25, 50, 75, 100, 125 и 150%.

Реакцията се задава с всички тези известни концентрации и абсорбцията се отчита при дължина на вълната 540 nm. С данните за известните концентрации и показанията на абсорбцията се прави кривата на калибриране.

При всяко определяне или партида на обработени проби се препоръчва да се монтира стандарт. Говежди серумен албумин 0,1-2 mg / ml може да се използва като стандарт за калибриране.

Измерванията се извършват на спектрофотометър при 540 nm.

Линейността се постига до концентрация от 12 g / dl.

смущения

Вещества, които пречат на теста Биурет

Въпреки че не е много често, трябва да се отбележи, че някои вещества могат да се намесят по време на изпълнението на този тест. Например, наличието на амоняк може да инхибира образуването на цвят.

По същия начин, други вещества могат да абсорбират със същата дължина на вълната, като някои пигменти.

От друга страна, интерференцията може да се генерира, когато вещество, различно от пептидната връзка, образува комплекс с купричната сол. Пример: някои въглехидрати и определени липиди.

В случай, че пробата, която се анализира, съдържа някакъв вид утайка, тя трябва да бъде филтрирана или центрофугирана преди монтирането на теста.

Вещества, които не пречат на Биуретовия тест

Тестът не се влияе от наличието на:

-Билирубин до концентрация 20 mg / dl.

-Хемоглобин до концентрация от 750 mg / dl.

-Декстран до концентрация 30 g / L.

-Триглицериди до концентрация 4000 mg / dl.

предимство

-Това е прост метод за изпълнение.

-Това е икономически тест.

-Има висока специфичност на протеините.

-Незначителна намеса.

Недостатъци

Има слаба чувствителност за откриване на ниски количества протеин. Работата, извършена от Fuentes et al., Потвърждава, че методът за изпитване Biuret има граница на откриване от 1 mg / ml протеин и граница за количествено определяне от 3 mg / ml.

Други изследвания, проведени в Университета на Амазония, обаче отчитат много по-ниски стойности. Лимитът за откриване, докладван от изследването, е 0,020 mg / ml, а ограничението за количествено определяне е 1,33 mg / ml.

Приложения

Биуретовият реагент или тестът се използва за определяне на протеини в клинични и неклинични проби в рутинни и изследователски лаборатории.

Патологии, които се появяват с увеличение или намаляване на

При много патологии е важно да се определи концентрацията на общите протеини в клиничните проби, която може да бъде повишена или намалена.

Те са повишени в:

-Множествена миелома, -Системен лупус еритематозус, -Бактериален ендокардит, -Бактериален менингит, Макроглобулинемията на Waldenstrom, наред с други.

Намалява се в:

-Бъбречна недостатъчност, - Хора с тежка степен на недохранване, -Пациенти с хронични инфекции, между другото.

Клинични проби

Най-често срещаните клинични проби са серум, плазма и урина. Нормалната стойност на протеините в серума или плазмата е 6,0-8,8 gr / dl.

Концентрацията на протеини в урината при възрастни не надвишава цифрата от 150 mg / 24 часа.

Съотношение протеин / урина креатинин в урината нормална стойност

Бебета: <0,50 mg

Деца на 2 години и повече: индекс: 0,20 mg

Възрастни: <0,2 mg

Неклинични проби

Реакцията на Biuret може да се използва за много видове неклинични проби, като млечни продукти, antivenom или всяко неизвестно вещество, за което искате да изследвате наличието на протеини.

Препратки

1. Vázquez J, Guerra L, Quintana J, Ramírez J, Fernando Ry Vazquez Y. (2014). Физико-химична характеристика и съдържание на протеини в течни екстракти от мангровата стрида (Crassostrearizophorae). Cuban Journal of Chemistry, 26 (1), 66-74. Произведено на 26 юни 2019 г. от http: //scielo.sld
2. Chaparro S, Lara A, Sandoval A, Sosa S, Martínez J, Gil J. Функционална характеристика на бадемовите семена от манго (Mangifera indica L.) Revista Ciencia en Desarrollo. 2015; 6 (1): 67-75
3. "Biuret". Уикипедия, Свободната енциклопедия. 19 юни 2019, 16:37 UTC. 26 юни 2019 г., 22:18 ч
4. Fuentes F, Quispe I, García J. Стандартизация на метода на Biuret за количествено определяне на общите протеини в поливалентния антиботропен серум, произведен в Националния център за биологични продукти INS. Бол - Инст Нак Салюд 2012; 18 (11-12). Достъпно на: repositorio.ins.gob.pe
5. Winer Laboratories. Общо протеини. Колориметричен метод за определяне на общите протеини в серума и плазмата. Достъпно на: wiener-lab.com.ar