ЦИТОХИМИЯ: ИСТОРИЯ, ОБЕКТ НА ИЗСЛЕДВАНЕ, ПОЛЕЗНОСТ И ТЕХНИКИ - БИОЛОГИЯ - 2025

В цитохимия включва поредица от техники, които разчитат на идентификация и разположението на специфични вещества вътре в клетката. Смята се за клон на клетъчната биология, който съчетава клетъчната морфология с химическата структура.

Според Бенсли, основател на приложението на съвременната цитология, изразява, че целта на цитохимията е да открие химическата организация на клетките, за да разбере мистериите на живота. Както и изучаване на динамичните промени, които настъпват по време на различните функционални етапи.

1: Извънболнично заболяване на Пейдж. (Хематоксилин-Еозин) 2: сенилни плаки, наблюдавани в мозъчната кора при пациент с болестта на Алцхаймер. (Сребърна импрегнация) 3: Заешки език, Колагенни влакна (син). Мускулни влакна (лилави ивици). (Трихром на Масон). 4: Чернодробна тъкан с мастна дегенерация. (Судан III) 5: Възпален черен дроб. Некроза. (Толуидин син) Източници: Уикипедия. com / Потребител: KGH / Файлове с обществени домейни / Mohit Lalwani

По този начин е възможно да се определи метаболитната роля, която играят тези вещества в клетката.

Цитохимията използва два основни метода. Първият се основава на химични и физични процедури. Тези техники прибягват до използването на микроскопа като незаменим инструмент за визуализиране на химичните реакции, които протичат върху специфични вещества в клетката.

Пример: използването на цитохимични оцветители, като Feulgen реакция или PAS реакция, наред с други.

Вторият метод се основава на биохимия и микрохимия. С тази методология е възможно количествено да се определи наличието на вътреклетъчни химикали.

Сред веществата, които могат да се разкрият в тъканна или клетъчна структура са следните: протеини, нуклеинови киселини, полизахариди и липиди.

История на цитохимията

Цитохимичните техники след тяхното изобретение помагат да се разбере състава на клетките и с течение на времето се появиха различни техники, които използват различни видове багрила с различни афинитети и основи.

Впоследствие цитохимията отвори нови хоризонти с използването на определени субстрати, за да покаже колориметрично присъствието на ензими или други молекули в клетката.

По същия начин са се появили и други техники като имуноцитохимия, която е от голяма полза при диагностицирането на много заболявания. Имуноцитохимията се основава на реакции антиген-антитела.

От друга страна, цитохимията също използва флуоресцентни вещества, наречени флуорохроми, които са отлични маркери за откриване на определени клетъчни структури. Поради характеристиките на флуорохром, той подчертава структурите, към които е бил прикрепен.

Какво учиш?

Различните цитохимични техники, използвани на биологична проба, имат нещо общо: те разкриват наличието на определен тип вещество и знаят местоположението му в оценяваната биологична структура, било то клетъчен тип или тъкан.

Тези вещества могат да бъдат ензими, тежки метали, липиди, гликоген и определени химически групи (алдехиди, тирозин и др.).

Информацията, предоставена от тези техники, може да даде насоки не само за идентифициране на клетки, но и за диагностициране на различни патологии.

Например, цитохимичните петна са много полезни при разграничаване между различните видове левкемии, тъй като някои клетки експресират определени ензими или ключови вещества, а други не.

От друга страна, трябва да се отбележи, че за да е възможно използването на цитохимията, трябва да се вземат предвид следните съображения:

1) Веществото трябва да бъде обездвижено на мястото, където се намира естествено.

2) Веществото трябва да бъде идентифицирано с помощта на субстрати, които реагират конкретно с него, а не с други съединения.

полезност

Пробите, които могат да бъдат изследвани чрез цитохимични техники са:

- Удължена периферна кръв.

- Удължен костен мозък.

- тъкани, фиксирани за хистохимични техники.

- Клетки, фиксирани чрез цитоцентрифугиране.

Цитохимичните техники са силно подкрепящи в областта на хематологията, тъй като те се използват широко за подпомагане на диагнозата и диференциацията на някои видове левкемии.

Например: Естеразните реакции се използват за разграничаване на миеломоноцитна левкемия от остра моноцитна левкемия.

Костномозъчният и периферната кръв от тези пациенти са сходни, тъй като някои клетки са трудни за идентифициране самостоятелно. За това се провежда тестът за естераза.

В първия специфичните естерази са положителни, докато във втория неспецифичните естерази са положителни.

Те са много полезни и в хистологията, тъй като например използването на техниката на оцветяване с тежки метали (импрегниране в сребро) оцветява ретикуларните влакна с интензивен кафяв цвят в миокардната тъкан.

Техники в цитохимията

Най-използваните техники ще бъдат обяснени по-долу:

- Използване на оцветители

Използваните петна са много разнообразни в цитохимичните техники и могат да бъдат класифицирани според няколко гледни точки:

Според радикала, към който имат афинитет

Те се делят на: кисели, основни или неутрални. Те са най-простите и най-използваните в цялата история, което ни позволява да различаваме базофилните компоненти от ацидофилните. Пример: оцветяване с хематоксилин-еозин.

В този случай ядрата на клетките оцветяват синьо (те приемат хематоксилин, който е основното петно), а цитоплазмите - червени (те приемат еозин, който е киселинното петно).

Според цвета, който предоставят

Те могат да бъдат ортохроматични или метахроматични. Ортохроматиките са тези, които оцветяват структурите със същия цвят, който има багрилото. Например случаят с еозин, чийто цвят е червен, а петна - червен.

От друга страна, метахроматиката оцветява структури, различни от техния цвят, като толуидин, чийто цвят е син и все пак оцветява виолетово.

Жизнени или надвитални багрила

Те са безвредни багрила, тоест оцветяват клетките и те остават живи. Тези петна се наричат ​​жизненоважни (напр. Трипан синьо за оцветяване на макрофаги) или надвитални (напр. Янус зелено за оцветяване на митохондрии или неутрално червено до оцветяване на лизозоми).

- Откриване на липиди с помощта на мастноразтворими багрила

Осмиев тетроксид

Оцветява липидите (ненаситени мастни киселини) черно. Тази реакция може да се наблюдава със светлинния микроскоп, но тъй като това багрило е с висока плътност, то може да се визуализира и с електронен микроскоп.

Судан III

Той е един от най-използваните. Тази багрила се дифундира и разтваря в тъканите, натрупвайки се вътре в липидните капчици. Цветът е червено червен.

Судан черно петно ​​B

Той създава по-добър контраст от предишните, тъй като е в състояние да се разтвори и във фосфолипиди и холестерол. Полезно е за откриване на азурофилни и специфични гранули от зрели гранулоцити и техните прекурсори. Следователно той идентифицира миелоидни левкемии.

- Оцветяване с алдехидна група (петно ​​с периодична киселина Шиф)

Периодната киселина Шиф петно ​​може да открие три вида алдехидни групи. Те са:

- свободни алдехиди, естествено присъстващи в тъканите (плазмена реакция).

- Алдехиди, получени чрез селективно окисляване (PAS реакция).

- Алдехиди, получени чрез селективна хидролиза (Феулгенова реакция).

PAS реакция

Това оцветяване се основава на откриване на някои видове въглехидрати, като гликоген. Периодна киселина Шиф нарушава СС връзките на въглехидратите поради окисляването на гликолови групи 1-2, като успява да освободи алдехидни групи.

Свободните алдехидни групи реагират с реактива на Шиф и образуват лилаво-червено съединение. Появата на лилаво-червения цвят показва положителна реакция.

Този тест е положителен в растителните клетки, откривайки нишесте, целулоза, хемицелулоза и пептини. Докато е в животинските клетки, той открива муцини, мукопротеини, хиалуронова киселина и хитин.

В допълнение, той е полезен при диагностицирането на лимфобластни левкемии или еритролеукемия, сред другите патологии от миелодиспластичен тип.

В случай на киселинни въглехидрати може да се използва алканското синьо петно. Тестът е положителен, ако се наблюдава светло син / тюркоазен цвят.

Плазмена реакция

Плазмената реакция разкрива наличието на някои дълговерижни алифатни алдехиди като палмово и стеарално. Тази техника се прилага върху замразени хистологични секции. Лекува се директно с реактива на Шиф.

Феулгенова реакция

Тази техника открива наличието на ДНК. Техниката се състои в подлагане на фиксираната тъкан на хидролиза на слаба киселина, за да може тя да реагира по-късно с реактива на Шиф.

Хидролизата излага дезоксирибоза алдехидните групи при дезоксирибоза-пуриновата връзка. След това реагентът на Шиф реагира с алдехидните групи, които са останали свободни.

Тази реакция е положителна в ядрата и отрицателна в цитоплазмите на клетките. Положителността се доказва от наличието на червен цвят.

Ако тази техника се комбинира с метил-зелен пиронин, е възможно едновременно откриване на ДНК и РНК.

- Цитохимични петна за протеинови структури

За това може да се използва реакцията на Милон, която използва живачен нитрат като реагент. Структурите, съдържащи ароматни аминокиселини, ще оцветят червено.

- Цитохимични петна, които използват субстрати, за да покажат наличието на ензими

Тези петна се основават на инкубацията на биологичната проба със специфичен субстрат и реакционният продукт впоследствие взаимодейства с диазо соли, за да образува оцветен комплекс.

естрази

Тези ензими присъстват в лизозомите на някои кръвни клетки и са способни да хидролизират органични естери, отделяйки нафтол. Последният образува неразтворимо азо багрило, когато се свързва с диазолна сол, оцветявайки мястото, където протича реакцията.

Има няколко субстрата и в зависимост от това кой се използва, могат да се идентифицират специфични естерази и неспецифични естерази. Първите присъстват в незрели клетки от миелоидната серия, а вторите в клетки с моноцитен произход.

Субстратът, използван за определяне на специфични естерази, е: нафтол-AS-D хлороацетат. Докато за определяне на неспецифични естерази могат да се използват няколко субстрата като нафтол AS-D ацетат, алфа нафтил ацетат и алфа нафтил бутират.

И в двата случая клетките ще се оцветят наситено червено, когато реакцията е положителна.

миелопероксидаза

Този ензим се намира в азурофилните гранули от гранулоцитни клетки и моноцити.

Откриването му се използва за разграничаване на левкемии от миелоиден произход от лимфоидни. Клетките, съдържащи миелопероксидази, пожълтяват охра.

фосфатаза

Тези ензими отделят фосфорни киселини от различни субстрати. Те се различават помежду си според спецификата на субстрата, рН и действието на инхибиторите и инактиваторите.

Сред най-известните са фосфомоноестеразите, които хидролизират прости естери (PO). Пример: алкална фосфатаза и кисела фосфатаза, както и фосфамидази, които хидролизират връзките (PN). Те се използват за диференциране на лимфопролиферативни синдроми и за диагностициране на космената клетъчна левкемия.

- Трихромни оцветители

Трихром Малари-Азан

Те са полезни за разграничаване на цитоплазмата на клетките от влакната на съединителната тъкан. Клетките оцветяват червено, а колагеновите влакна синьо.

Трихром на Масон

Това има същата полезност като предишната, но в този случай клетките оцветяват червено, а колагеновите влакна - зелени.

- Багрила, които оцветяват специфични органели

Янус Грийн

Селективно оцветява митохондриите.

Сребърни соли и осмична киселина

Оцветява апарата Голджи.

Толуидин синьо

Оцветява телата на Ниси

Сребърни соли и PAS

Те оцветяват ретикуларните влакна и базалната ламина.

Орцеин и фуксин резорцин

Те боядисват еластични влакна. С първата те са обагрени в кафяво, а с втората наситено синьо или лилаво.

- Други техники, използвани в цитохимията

Използване на флуоресцентни вещества или флуорохроми

Има техники, които използват флуоресцентни вещества за изследване на местоположението на структурата в клетката. Тези реакции се визуализират със специален микроскоп, наречен флуоресценция. Пример: IFI техника (непряка имунофлуоресценция).

Откриване на клетъчни компоненти чрез имуноцитохимия

Тези техники са много полезни в медицината, тъй като помагат да се открие определена клетъчна структура и също да се определи количествено. Тази реакция се основава на реакция антиген-антитяло. Например: ELISA техники (Enzyme Immuno Assay).

препоръки

- Необходимо е да се използват контролни мазки, за да се оцени доброто представяне на багрилата.

- Пресни мазки трябва да се използват за цитохимично оцветяване. Ако не е възможно, те трябва да се съхраняват защитени от светлина и да се съхраняват при 4 ° C.

- Трябва да се внимава използваният фиксатор да не влияе отрицателно върху веществото, което ще се изследва. С други думи, трябва да се предотврати възможността да се извлече или инхибира.

- Времето на употреба на фиксаторите трябва да се спазва, тъй като като цяло то трябва да трае само секунди, тъй като излагането на намазка за по-дълго време на фиксатора може да повреди някои ензими.

Препратки

1. "Цитохимия". Уикипедия, Свободната енциклопедия. 30 юни 2018, 17:34 UTC. 9 юли 2019, 02:53 Достъпно в: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Методи за метално импрегниране за изследване на миокардни ретикуларни влакна: сравнително изследване. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Достъпно на: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Цитохимия на киселата фосфатаза: методологически съображения. Rev Diagn Biol. 200; 50 (2): 89-92. Достъпно на: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Клетъчна и молекулярна биология. 11-то издание. Редакция Ateneo. Буенос Айрес, Аржентина.
5. Класически инструменти за изучаване на клетъчната биология. TP 1 (допълнителен материал) - клетъчна биология. Достъпно на: dbbe.fcen.uba.ar