ХИСТОХИМИЯ: ОБОСНОВКА, ОБРАБОТКА, ОЦВЕТЯВАНЕ - БИОЛОГИЯ - 2025

В хистохимични е полезен инструмент за изследване на морфологията на различни биологични тъкани (растения и животни) поради реакция принцип на компоненти тъкан като въглехидрати, липиди и протеини, между другото, химически багрила.

Този ценен инструмент позволява не само да се идентифицира състава и структурата на тъканите и клетките, но и различните реакции, които се проявяват в тях. По същия начин може да се докаже възможно увреждане на тъканите, причинено от наличието на микроорганизми или други патологии.

Хистохимични петна. Нил вирус, Грам положителни и Грам отрицателни бактерии (Грам), Хистоплазма капсулатум (Грокот), Mycobacterium tuberculosis (Ziehl Neelsen). Източник: Pixinio.com/Wikipedia.org/Nephron / CDC / Dr. Джордж П. Кубица

Хистохимията от минали векове е имала важни приноси, като демонстрацията на съществуването на кръвно-мозъчната бариера от Пол Ерлих. Това беше възможно, защото мозъкът на експерименталното животно, използвано от Ерлих, не беше оцветен с анилин, което е основно багрило.

Това доведе до използването на различни оцветители като метиленово синьо и индофенол, за да се оцветят различните видове клетки. Тази констатация доведе до класифицирането на клетките в ацидофилни, базофилни и неутрофилни, според тяхното специфично оцветяване.

Последните проучвания прилагат тази техника, за да покажат наличието на различни съединения, включително феноли, както и въглехидрати и неструктурни липиди, в тъканите на вида Litsea glaucescens, по-известен като лавр. Намирането на тези, както в листата, така и в гората.

По същия начин, Colares et al, 2016, идентифицира растението с лекарствен интерес Tarenaya hassleriana, използвайки хистохимични техники. При този вид е доказано наличието на нишесте, мирозин, както и фенолни и липофилни съединения.

основа

Хистохимията се основава на оцветяването на клетъчни структури или молекули, присъстващи в тъканите, благодарение на афинитета им към специфични багрила. Реакцията на оцветяване на тези структури или молекули в оригиналния им формат, по-късно се визуализира в оптичния микроскоп или електронния микроскоп.

Специфичността на оцветяването се дължи на присъствието на йон-приемащи групи, присъстващи в клетки или тъканни молекули.

И накрая, целта на хистохимичните реакции е да могат да се покажат чрез оцветяване. От най-големите биологични структури до най-малките от тъканите и клетките. Това може да се постигне благодарение на факта, че багрилата реагират химически с молекулите на тъканите, клетките или органелите.

преследване

Хистохимичната реакция може да включва стъпки преди извършване на техниката, като фиксиране, вграждане и разрязване на тъканта. Ето защо трябва да се вземе предвид, че в тези стъпки структурата, която трябва да бъде идентифицирана, може да бъде повредена, което ще доведе до фалшиви отрицателни резултати, дори ако е налице.

Въпреки това предварителното фиксиране на тъканта, проведено правилно, е важно, тъй като предотвратява автолизата или разрушаването на клетките. За това се използват химични реакции с органични разтворители като: формалдехид или глутаралдехид, между другото.

Включването на тъканта се извършва така, че да запазва своята твърдост при нарязване и по този начин да не позволява да се деформира. И накрая, разрезът се прави с микротом за изследване на проби чрез оптична микроскопия.

Освен това, преди да продължите с хистохимичното оцветяване, се препоръчва да се включат външни или вътрешни положителни контроли във всяка партида тестове. Както и използването на специфични багрила за структурите, които ще се изучават.

Хистохимични петна

От появата на хистохимични техники до наши дни са използвани широка гама петна, включително и тези, които най-често се използват, като: периодична киселина Шиф (PAS), Grocott, Ziehl-Neelsen и Gram.

По същия начин, други оцветители са били използвани по-рядко, като например мастило от Индия, орцеин или трихромно петно ​​на Масон, наред с други.

Шиф на периодична киселина (PAS)

С това оцветяване могат да се наблюдават молекули с високо съдържание на въглехидрати, като: гликоген и муцин. Той обаче е полезен и за идентифициране на микроорганизми като гъбички и паразити. В допълнение към определени структури (базисна мембрана) в кожата и други тъкани.

Основата за това оцветяване е, че багрилото окислява въглеродните връзки между две близки хидроксилни групи. Това води до освобождаване на алдехидната група и това се открива от реагента на Шиф, излъчвайки лилав цвят.

Реагентът на Шиф се състои от основен фуксин, натриев метабисулфит и солна киселина, като тези компоненти са отговорни за оцветяването на пурпур, когато присъстват алдехидни групи. В противен случай се получава безцветна киселина.

Интензитетът на оцветяването ще зависи от количеството хидроксилни групи, присъстващи в монозахаридите. Например при гъбички, мембрани на мазето, муцини и гликоген цветът може да варира от червено до лилаво, докато ядрата оцветяват синьо.

Grocott

Това е едно от петната с най-висока чувствителност при идентифицирането на гъбички в тъкани, вградени в парафин. Това позволява идентифицирането на различните гъбични структури: хифи, спори, ендоспори, наред с други. Поради това се счита за рутинно петно ​​за диагностициране на микоза.

Той се използва особено при диагностицирането на белодробни микози като пневмоцистоза и аспергилоза, причинени съответно от някои гъбички от родовете Pneumocystis и Aspergillus.

Този разтвор съдържа сребърен нитрат и хромова киселина, като последният е фиксатор и оцветител. Обосновката е, че тази киселина произвежда окисляването на хидроксилни групи до алдехиди чрез мукополяхариди, присъстващи в гъбични структури, например в клетъчната стена на гъбите.

Накрая, среброто, присъстващо в разтвора, се окислява от алдехидите, причинявайки черно оцветяване, което се нарича аргентафинова реакция. Могат да се използват и контрастни оцветители като светло зелено и по този начин гъбичните структури ще се наблюдават в черно със светло зелен фон.

Ziehl-Neelsen

Това оцветяване се основава на наличието на киселинно-алкохолна резистентност, частично или изцяло, в някои микроорганизми като родовете Nocardia, Legionella и Mycobacterium.

Използването на това петно ​​се препоръчва, тъй като клетъчната стена на споменатите по-горе микроорганизми съдържа сложни липиди, които възпрепятстват проникването на багрилата. Особено в проби от дихателните пътища.

В него се използват силни оцветители като карболов фуксин (основен оцветител) и се прилага топлина, така че микроорганизмът да запази оцветителя и той да не се обезцвети с киселини и алкохоли. И накрая, разтвор от метиленово синьо се прилага за оцветяване на структурите, които са се обезцветили.

Наличието на киселинно-алкохолна устойчивост се наблюдава при структури, оцветени в червено, докато структурите, които не издържат на избледняване, са оцветени в синьо.

Грам и китайско мастило

Грамът е много полезно петно ​​при диагностицирането на бактериални и гъбични инфекции, наред с други. Това оцветяване дава възможност да се прави разлика между грам-положителни и грам-отрицателни микроорганизми, ясно показвайки разликите, които съществуват в състава на клетъчната стена.

Докато мастилото в Индия е петно, което се използва за контрастиране на структури, които съдържат полизахариди (капсула). Това е така, защото в околната среда се образува пръстен, който е възможен при Cryptococcus neoformans.

Orcein

С това оцветяване еластичните влакна и хромозомите на различни клетки се оцветяват, което позволява да се оцени процеса на зреене на последните. Поради тази причина той е бил много полезен при цитогенетичните изследвания.

Това се основава на усвояването на багрилото от отрицателния заряд на молекули като ДНК, присъстващи в ядрата на голямо разнообразие от клетки. Така че те са оцветени в синьо до тъмно лилаво.

Трихром на Масон

Това петно ​​се използва за идентифициране на някои микроорганизми или материали, които съдържат меланични пигменти. Такъв е случаят с микозите, причинени от гнойни гъби, феохифомикоза и евмицетом от черно зърно.

Заключителни мисли

През последните години има голям напредък в създаването на нови диагностични техники, при които хистохимията участва, но е свързана с други основи или принципи. Тези техники имат различно предназначение, както в случая с имунохистохимия или ензимохистохимия.

Препратки

1. Acuña U, Elguero J. Histoquímica. Ан. Хим. 2012; 108 (2): 114-118. Достъпно на: are.iqm.csic.es
2. Mestanza R. Честота на хистохимични петна от PAS, Grocott и Ziehl-Neelsen, използвани за идентифициране на микроорганизми, проведени в Патологичната служба за анатомия на Специализирана болница Eugenio Espejo през 2015 г. Централен университет в Еквадор, Кито; 2016.Наличен на адрес: dspace.uce.edu
3. Tapia-Torres N, de la Paz-Pérez-Olvera C, Román-Guerrero A, Quintanar-Isaías A, García-Márquez E, Cruz-Sosa F. Хистохимия, общо съдържание на фенол и антиоксидантна активност на листата и дървесината на лицея glaucescens Kunth (Lauraceae). Дървесина и гори. 2014; 20 (3): 125-137. Достъпно на адрес: redalyc.org
4. Colares, MN, Martínez-Alonso, S, Arambarri, AM. Анатомия и хистохимия на Tarenaya hassleriana (Cleomaceae), вид от медицински интерес. Латиноамерикански и карибски бюлетин на лекарствените и ароматни растения 2016; 15 (3): 182-191. Достъпно на адрес: redalyc.org
5. Бонифаз А. Основна медицинска микология. 4-то издание. Мексико: McGraw-Hill Interamericana editores, SA de CV 2012.
6. Силва Диего Филипе Безерра, Сантос Хелен Бандейра де Понтес, Леон Хорхе Ескиче, Гомес Далиана Кейрога де Кастро, Алвес Полиана Муниз, Нонака Касиано Франсиско Вееге. Клинико патологичен и имунохистохимичен анализ на плоскоклетъчен карцином на езика на шпиндела: рядък случай. Айнщайн (Сао Пауло) 2019; 17 (1): eRC4610. Достъпно от: scielo.br