ИМУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ: ОБОСНОВКА, ПРОТОКОЛ И ПРИЛОЖЕНИЯ - БИОЛОГИЯ - 2025

На имунофлуоресценцията е мощна техника имунооцветяване, използвайки антитела, ковалентно свързани към флуоресцентни молекули, за да се идентифицират специфични цели в клетъчни проби фиксирани върху твърда подложка.

Тази техника включва микроскопично наблюдение с имунологична специфичност, което позволява да се наблюдават живи или мъртви клетки, които могат да представят незначителни количества антигени. Той се използва широко както в областта на изследванията, така и в клиничната диагностика на различни патологии.

Имуномаркиране на актиновите нишки в кардиомиоцитните клетки (Източник: Ps1415 чрез Wikimedia Commons)

Тази техника, главно качествена (с някои количествени варианти), е свързана конкретно с визуализацията на пробата от сигнала на продукта на флуорофор, който е флуоресцентна молекула, свързана с антитяло и която може да се възбужда при определена дължина на вълната.,

В клетъчния контекст е много полезно да се изследва наличието / отсъствието и субклетъчното разположение на протеините. Първоначално техниката се използва в клиничните условия за диагностициране на вируси като грип и впоследствие за много други инфекциозни заболявания.

Това е силно чувствителна техника и с подходящото оборудване за микроскопия може да има много добра резолюция. За неговото наблюдение се изисква използването на конфокални или епифлуоресцентни микроскопи.

Въпреки че е много популярен, той може да създаде някои важни проблеми по отношение на получаването на неспецифична флуоресценция, която генерира някакъв фонов „шум“, който често ограничава адекватното четене на резултатите.

основа

Имунофлуоресценцията се основава на използването на биологичния феномен на реакцията на взаимодействие между антитяло и антиген. Това е свързано конкретно с визуализацията или откриването на тази реакция чрез вълнуващи флуоресцентни молекули до определена дължина на вълната.

Антитялото е имуноглобулинов протеин, секретиран от активни В клетки, който е генериран специално срещу антиген, към който може да се свърже с голям афинитет и специфичност. Имунофлуоресценцията използва IgG имуноглобулини, които са разтворими в кръвния серум.

Антителата са молекули до 950 kDa, съставени от две къси (леки) и две дълги „Y” -образни (тежки) пептидни вериги. И леките, и тежките вериги са разделени на два домена: една променлива, способна да разпознава антигена, а другата постоянна или запазена, характерна за всеки вид.

Антигените са функционално дефинирани като молекули, които могат да бъдат разпознати от антитяло и в по-голямата си част са протеини. Когато животно е изложено на антиген, лимфоцитите на имунната система се активират, произвеждайки специфични антитела срещу него и които функционират като защитна система.

Един антиген, като протеин, например, може да има повече от един епитоп или място на разпознаване от антитяло, като по този начин серумът на животното, изложен на антиген, може да има поликлонални антитела срещу различни региони на един и същи протеин.

Имунофлуоресценцията, след това, използва способността на животно да произвежда поликлонални антитела срещу специфичен антиген, за да го пречисти и впоследствие да го използва за откриване на същия антиген в други контексти.

Сред флуоресцентните багрила или молекули, които най-често се използват за някои имунофлуоресцентни техники са флуоресцеин изотиоцианат (FITC), тетраметилродамин изотиоцианат-5 и 6 (TRITC), много цианини като Cy2, Cy3, Cy5 и Cy7 и багрила, наречени Alexa Fluor®, като Alexa Fluor®448.

протокол

Имунофлуоресцентният протокол варира в зависимост от много фактори, но като цяло той обхваща линейна последователност от етапи, състояща се от:

• Подготовка на плочите и клетките
• Фиксиране на проби
• Пермеабилизирането
• Блокирането
• Имунооцветяване или имунооцветяване
• Сглобяване и наблюдение

-Изготвяне

От пробите

Подготовката на пробите ще зависи от техния характер и вида опит, който ще се извърши. Най-простият случай, който включва използването на клетки в суспензия, ще бъде обяснен по-долу.

Клетките в суспензия, тоест в течна културна среда, първо трябва да бъдат отделени от нея чрез центрофугиране и след това трябва да бъдат промити с буферен разтвор или изосмотичен "буфер", който запазва тяхната цялост.

Обикновено се използва фосфатно-солев буфер, известен като PBS, в който клетките се ресуспендират и тази смес се центрофугира отново, за да се получат клетките, свободни от културната среда, която може да съдържа смущаващи вещества.

От остриетата

Слайдовете, използвани за микроскопично наблюдение, където клетките по-късно ще бъдат фиксирани за съответните обработки надолу по веригата, също трябва да бъдат внимателно подготвени.

Те са покрити или "сенсибилизирани" с разтвор на поли-лизин, синтетичен полимер, който ще действа като "молекулно лепило" между клетките и твърдата подложка, благодарение на електростатичното взаимодействие между положителните заряди на техните аминогрупи и отрицателни заряди върху протеините, които покриват клетките.

Фиксиране на проби

Този процес се състои в обездвижване на протеините, намиращи се в клетката, за да се запази тяхното пространствено местоположение непокътнато. Използваните молекули трябва да могат да кръстосват всички видове клетъчни мембрани и да образуват решетки с ковалентните протеини.

Широко се използват формалдехид и параформалдехид, глутаралдехид и дори метанол, с които клетъчните проби се инкубират за известно време и след това се промиват с изосмотичен буферен разтвор.

След фиксирането на клетките те продължават да се прикрепят към листовете, предварително сенсибилизирани с поли-лизин.

Пермеабилизирането

В зависимост от типа тест, който се провежда, ще е необходимо пермеабилизирането на изследваните клетки или не. Ако се иска да се знае местоположението, присъствието или отсъствието на определен протеин на клетъчната повърхност, пермеабилизирането няма да е необходимо.

От друга страна, ако искате да знаете местоположението на протеин вътре в клетката, пермеабилизацията е от съществено значение и ще се състои в инкубиране на пробите с Triton X-100, детергент, способен да прониква клетъчните мембрани.

Блокирането

Основна стъпка във всички имунологични техники е блокирането. На този етап от процедурата блокирането се състои в покриване на сенсибилизираните листове всички места с полилизинови молекули, към които клетките не се прилепват. Тоест, предотвратява всяко неспецифично обединение.

Обикновено разтвори с говежди серумен албумин (BSA) в PBS буфер се използват за блокиране и най-добрите резултати се получават, колкото по-дълго е инкубационното време с този разтвор. След всяка стъпка, включително блокиране, е необходимо да се отмие останалото решение.

Имунооцветяване или имунооцветяване

Процесът на имунооцветяване или имунооцветяване ще зависи главно от това дали е пряка или непряка имунофлуоресценция (виж по-долу).

Ако това е първична или директна имунофлуоресценция, пробите ще бъдат инкубирани с желаните антитела, които трябва да бъдат свързани с флуоресцентни багрила. Инкубационната процедура се състои в разреждане на антитялото в разтвор, който също ще съдържа BSA, но в по-ниска пропорция.

Когато случаят е с вторична или непряка имунофлуоресценция, трябва да се извършат две последователни инкубации. Първо с желаните антитела и след това с антителата, които са способни да откриват константните участъци на първичните имуноглобулини. Именно тези вторични антитела са ковалентно свързани с флуорофори.

Техниката е много гъвкава, позволява едновременно маркиране на повече от един антиген на проба, стига да има първични антитела, свързани с различни флуорофори, в случай на директна имунофлуоресценция.

За едновременно маркиране в непряка имунофлуоресценция е необходимо да се гарантира, че всяко първично антитяло се произвежда в различно животно, както и че всяко вторично антитяло е свързано с различен флуорофор.

Подобно на блокирането, инкубацията с антитела дава по-добри резултати, колкото по-дълго е времето за това. След всеки етап е необходимо да се промият излишните антитела, които не се свързват с пробите и във вторичната имунофлуоресценция е необходимо да се блокира, преди да се добави вторичното антитяло.

Някои техники използват други петна, които не са свързани с имунооцветяване, като оцветяване на ядрена ДНК с флуорофор DAPI.

Сглобяване и наблюдение

По време на последното време на инкубация с флуорофорите е необходимо пробите да останат на тъмно. За наблюдение под микроскоп е обичайно да се използват някои вещества за запазване на флуоресценцията на флуорофорите, съчетани с антителата.

Видове

Графично обобщение на директната и индиректната имунофлуоресценция (Източник: Westhayl618 чрез Wikimedia Commons)

Директна или първична имунофлуоресценция

Това е свързано с откриването на антигени чрез използването на флуоресцентни антитела. Основното предимство на използването на тази техника е нейната скорост, но в процеса могат да възникнат много случаи на неспецифично свързване, особено при изследване на човешки серуми, тъй като те са богати на силно хетерогенни антитела.

Косвена или вторична имунофлуоресценция

Известна е още като техниката „сандвич“ и това включва разработването на техниката в две стъпки. Първото е свързано с използването на нефлуоресцентно антитяло и неговото свързване с интересуващия антиген.

Срещу постоянния участък на това първо антитяло (което сега ще служи като антиген) се използва второ антитяло, способно да го разпознае, което е свързано с флуоресцентна молекула.

Появата на флуоресцентен сигнал ще бъде резултат от специфично разпознаване между първото нефлуоресцентно антитяло и интересуващия антиген; присъствието на това първо антитяло условие на това на второто, което е белязано и благодарение на което може да се определи присъствието или отсъствието на антигена.

Въпреки че е много по-отнемаща време техника, отколкото директната имунофлуоресценция (тъй като включва още един етап на инкубация), тази техника не включва проектирането на флуоресцентно антитяло за всеки изследван антиген, което води до икономическа гледна точка, по-жизнеспособни.

Освен това, тя е по-чувствителна техника по отношение на усилването на сигнала, тъй като повече от едно вторично антитяло може да се свърже към константния участък на първичното антитяло, като по този начин усили интензивността на флуоресцентния сигнал.

Приложения

Както може би беше отбелязано по-рано, имунофлуоресценцията е изключително многостранна техника, която се използва по много начини в научната и клиничната област. Може да се използва за отговор на екологични, генетични и физиологични въпроси относно много организми.

Сред клиничните приложения се използва за директна диагностика на някои дерматологични заболявания, като се използва директна или индиректна имунофлуоресценция върху епителната тъкан на изследваните пациенти.

Имунофлуоресцентни техники са налични в едноклетъчни организми като дрожди за визуализиране на вътреядрени и цитоплазмени микротрубочки, актин и свързани протеини, 10 nm нишки и други съставки на цитоплазмата, мембраната и клетъчните стени.

Препратки

1. Abcam, имуноцитохимия и имунофлуоресцентен протокол. Извлечено от abcam.com
2. Греф, С. (2012). Флуоресцентни багрила. Извлечено от leica-microsystems.com
3. Miller, DM, и Shakest, DC (1995). Имунофлуоресцентна микроскопия. „Методи в клетъчната биология“ (том 48, стр. 365–394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID, & Cook, D. (2013). Имунофлуоресцентни техники. Списание за разследваща дерматология, 133, 1–4.
5. Принц, BJR, Адамс, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Имунофлуоресцентни методи за мая. В методите на ензимологията (том 194, стр. 565–602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V, & Widelock, D. (1964). Приложения на имунофлуоресценцията в вирусологията на общественото здраве. Бактериологични рецензии, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG и Anderson, DM (1996). Имунофлуоресценция в изследванията на фитопланктона: приложения и потенциал. J: Фикол., 32, 1–16.