- От какво се състои тя?
- Видове микрочипове
- процес
- Изолация на РНК
- Производство и етикетиране на кДНК
- Хибридизацията
- Отчитане на системата
- Приложения
- Рак
- Други заболявания
- Препратки
A ДНК микрочип, наречен ДНК чип или ДНК микрочип, се състои от серия от ДНК фрагменти закотвени към физическа подкрепа на променлива материал, било то пластмаса или стъкло. Всяко парче ДНК представлява последователност, допълваща специфичен ген.
Основната цел на микроматриците е сравнителното изследване на експресията на определени интересуващи се гени. Например, обичайно е тази техника да се прилага върху две проби - една в здравословни условия и една патологична - за да се идентифицират кои гени се експресират и кои не са в пробата със състоянието. Споменатата проба може да бъде клетка или тъкан.
От Paphrag от английската Wikipedia (Прехвърлена от en.wikipedia в Commons.), Чрез Wikimedia Commons
Обикновено експресията на гени може да бъде открита и количествено определена благодарение на използването на флуоресцентни молекули. Манипулацията с чиповете се извършва в повечето случаи от робот и едновременно могат да бъдат анализирани голям брой гени.
Тази нова технология е полезна за широк спектър от дисциплини, от медицинска диагностика до различни изследвания на молекулярната биология в областта на протеомиката и геномиката.
От какво се състои тя?
ДНК (дезоксирибонуклеинова киселина) микрочипове са набор от специфични ДНК сегменти, прикрепени към твърда матрица. Тези последователности се допълват с гените, които искат да бъдат изследвани и могат да бъдат до 10 000 гена на cm 2.
Тези характеристики позволяват систематичното и мащабно проучване на генната експресия на организъм.
Информацията, която клетката трябва да функционира, е кодирана в единици, наречени „гени“. Определени гени съдържат инструкциите за създаване на основни биологични молекули, наречени протеини.
Генът се изразява, ако неговата ДНК се транскрибира в междинна пратена РНК молекула и експресията на гена може да варира в зависимост от нивото на транскрипция на този сегмент от ДНК. В определени случаи промяната в израза може да е показателна за заболявания.
Принципът на хибридизация прави възможна работата на микрорешетки. ДНК е молекула, изградена от четири типа нуклеотиди: аденин, тимин, гуанин и цитозин.
За да се образува двойна спирална структура, аденинови групи с тимин и цитозин с гуанин. По този начин, две допълващи се вериги могат да бъдат съединени с водородни връзки.
Видове микрочипове
По отношение на структурата на микрореактивите има две вариации: потребителски допълващи се ДНК или олигонуклеотидни съединения и търговски микрорешетки с висока плътност, произведени от търговски компании, като Affymetrix GeneChip.
Първият тип микромасив позволява анализ на РНК от две различни проби на един чип, докато вторият вариант е от търговски тип и има голям брой гени (например Affymetrix GeneChip има около 12 000 човешки гена), което позволява да се анализира една проба.
процес
Изолация на РНК
Първата стъпка в провеждането на експеримент, използващ технологията microarray, е изолирането и пречистването на молекулите на РНК (може да бъде вестител РНК или други видове РНК).
Ако искате да сравните две проби (здрави срещу болни, контролно спрямо лечение, между другото), трябва да се извърши изолирането на молекулата в двете тъкани.
Производство и етикетиране на кДНК
Впоследствие РНК се подлага на обратна транскрипция в присъствието на белязани нуклеотиди и по този начин ще бъде получена комплементарната ДНК или сДНК.
Етикетът може да бъде флуоресцентен и трябва да се различава между двете тъкани, които ще бъдат анализирани. По традиционен начин се използват флуоресцентните съединения Cy3 и Cy5, тъй като те излъчват флуоресценция с различна дължина на вълната. В случая на Cy3 това е цвят, близък до червен, а Cy5 съответства на спектъра между оранжево и жълто.
Хибридизацията
СДНК се смесват и инкубират в ДНК микромасив, за да се позволи хибридизация (т.е. се осъществява свързване) на кДНК от двете проби с частта от ДНК, имобилизирана върху твърдата повърхност на микромасива.
По-висок процент на хибридизация с сондата в микроматрицата се интерпретира като по-висока тъканна експресия на съответната тРНК.
Отчитане на системата
Количественото определяне на израза се осъществява чрез включване на читателска система, която присвоява цветен код на количеството флуоресценция, излъчвано от всяка кДНК. Например, ако червеното се използва за маркиране на патологичното състояние и то се хибридизира в по-висока пропорция, червеният компонент ще бъде преобладаващият.
С тази система може да се знае свръхекспресията или репресията на всеки ген, анализиран и в двете избрани условия. С други думи, стенограмата на пробите, оценени в експеримента, може да бъде известна.
Ларсоно, от Wikimedia Commons
Приложения
В момента микрорежимите се считат за много мощни инструменти в медицинската област. Тази нова технология позволява диагностицирането на заболявания и по-добро разбиране за това как се променя генната експресия при различни медицински условия.
Освен това той позволява да се сравнява контролна тъкан и тъкан, третирана с определено лекарство, за да се проучат ефектите от възможното медицинско лечение.
За да направите това, нормалното състояние и болното състояние се сравняват преди и след прилагането на лекарството. Изучавайки ефекта на лекарството върху генома in vivo, имаме по-добър преглед на неговия механизъм на действие. Също така може да се разбере защо някои конкретни лекарства водят до нежелани странични ефекти.
Рак
Ракът оглавява списъците с болестите, изследвани с ДНК микрорешета. Тази методология се използва за класификацията и прогнозата на заболяването, особено в случаите на левкемии.
Изследователското поле на това състояние включва компресиране и характеризиране на молекулните основи на раковите клетки, за да се намерят модели на генна експресия, които водят до неуспехи в регулирането на клетъчния цикъл и в процесите на клетъчна смърт (или апоптоза).
Други заболявания
Чрез използването на микрочипове е възможно да се изяснят диференциалните профили на експресия на гени при медицински състояния на алергии, първични имунодефицити, автоимунни заболявания (като ревматоиден артрит) и инфекциозни заболявания.
Препратки
- Беднар, М. (2000). Технология и приложение на DNA microarray Medical Science Monitor, 6 (4), MT796-MT800.
- Kurella, M., Hsiao, LL, Yoshida, T., Randall, JD, Chow, G., Sarang, SS,… & Gullans, SR (2001). ДНК микрочислен анализ на сложни биологични процеси. Списание на Американското дружество по нефрология, 12 (5), 1072-1078.
- Nguyen, DV, Bulak Arpat, A., Wang, N., & Carroll, RJ (2002). ДНК микромасични експерименти: биологични и технологични аспекти. Биометрия, 58 (4), 701-717.
- Plous, CV (2007). ДНК микрочипове и техните приложения в биомедицински изследвания. Списание CENIC. Биологични науки, 38 (2), 132-135.
- Wiltgen, M., & Tilz, GP (2007). Анализ на ДНК микрочипове: принципи и клинично въздействие. Хематология, 12 (4), 271-287.