ДНК СЕКВЕНИРАНЕ: МАКСАМ-ГИЛБЕРТ, МЕТОД И ПРИМЕРИ - БИОЛОГИЯ - 2025

В последователността на ДНК (дезоксирибонуклеинова киселина) е процедура, в молекулярни лаборатории биология, която позволява да се знае от порядъка на нуклеотиди в генетичния материал на интерес. Освен това, секвенирането на РНК (рибонуклеинова киселина) също може да бъде разкрито.

Тази техника е била незаменима за развитието на биологичните науки. Той е приложим и за други области на знанието - като например медицинска диагностика и съдебномедицински разследвания.

Източник: pixabay.com

Преди това секвенирането на ДНК верига се счита за бавна и скъпа активност, което позволява идентифицирането на само няколко базови двойки в олигонуклеотидите.

Днес, с всички постижения в науката, секвенцирането на ДНК е рутинна операция в много лаборатории по целия свят, благодарение на приноса на почти 50 години изследвания в тази област. По отношение на дължината на веригата, до много милиони базови двойки могат да бъдат секвенирани за много кратко време.

За целта има разработени десетки техники, които се различават по цена и прецизност. В тази статия ще опишем както класическите, така и модерните техники, всяка със своите предимства и недостатъци.

Досега техники за секвениране позволяват получаването на последователността на пълни геноми, от малки прокариоти и дрожди до човешкия геном.

ДНК структура

За да се разберат методите и техниките, използвани за секвениране на ДНК, е необходимо да се знаят някои ключови аспекти на структурата и състава на молекулата.

ДНК е биомолекула, която се намира във всички живи същества, от бактерии до големи водни животни. Органелите - като митохондриите и хлоропластите - имат кръгова молекула на ДНК вътре в тях. Дори при някои вируси откритият генетичен материал е ДНК.

В структурно отношение ДНК е съвкупност от нуклеотиди. Всеки от тях е съставен от въглехидрати, азотна основа (A, T, C или G) и фосфатна група. Целта на секвенирането на ДНК е да се разкрие реда, в който четирите азотни основи се намират в последователността.

история

В средата на 50-те години на миналия век изследователите Уотсън и Крик описват структурата на ДНК, използвайки христолографски техники. Никой от тези изследователи обаче не успя да намери начин да разгадае последователността.

Въпреки че имаше определени предшественици, най-важното събитие беше създаването на метода Сангер, през 1977 г. Фредерик Сангер, бащата на метода, беше британски биохимик, носител на две Нобелови награди за огромния си принос в биологичните науки.

Тази техника също е известна в литературата като "прекъсване на веригата" или дидеоксинуклеотиди. Принципите на тази техника и тези, които са разработени въз основа на нейното усъвършенстване и иновации, ще бъдат описани по-долу.

Сангер метод

Развитието на метода на Сангер представлява решаващо събитие в молекулярната биология. Тя включва основните компоненти на процеса на репликация на ДНК, който обикновено се случва в клетката, но добавя специален компонент: дидеоксинуклеотиди.

Основни компоненти на реакцията

- ДНК полимераза: ензимът ДНК полимераза е решаващ елемент от процеса. Тази молекула участва в репликацията на ДНК веригата и нейната роля е синтеза на новата верига, сдвояването на трифосфатните дезоксирибонуклеотиди с комплементарните.

Спомнете си, че в ДНК тимините (Т) се сдвояват с аденини (А) чрез две водородни връзки, докато цитозин (С) прави това с гуанин (G) чрез три връзки.

- Нуклеотиди: Сингерното секвениране включва два типа нуклеотиди, четирите 2'-дезоксинуклеотиди (съкратено като dATP, dGTP, dCTP и dTTP) и четирите дидеоксинуклеотиди (ddATP, ddGTP, ddCTP и ddTTP).

Въпреки че дидеоксинуклеотидите са подобни на мономерите, които нормално се включват в ДНК, те нямат група -OH в структурата си. Това прави невъзможно добавянето на нов нуклеотид към веригата.

Следователно, когато към веригата във формирането се добавя специален нуклеотид - по напълно случаен начин, синтезата се парализира. По този начин в края на реакцията има вериги с различни размери, всяка от които реакцията е спряна в различна точка.

Експериментално са подготвени четири теста. Всяка съдържа ДНК, извлечена от интересуващата се биологична проба, нормалните нуклеотиди и един от четирите специални типа нуклеотиди. Или специалните нуклеотиди са маркирани с някакъв тип флуоресцентен маркер (вижте автоматичното секвениране по-долу).

Четене на резултатите

Първата стъпка е да отделите всяка от синтезираните вериги според техния размер. Някои ще са по-дълги от другите, в зависимост от това къде са били включени специалните бази.

Съществуват различни биохимични техники, които позволяват разделянето на компонентите на сместа, като се използва размер като дискриминационно свойство. При метода на Сангер различните вериги са разделени с електрофореза. В по-сложните варианти на техниката се използва капилярна електрофореза.

По този начин, по-дългите кичури пътуват по-малко от по-късите варианти. След това тази система преминава през четец, който разпознава маркера, включен във всеки дидеоксинуклеотид. По този начин може да се знае редът на последователността.

Тази техника от първо поколение може да чете ДНК фрагменти, не по-големи от 1 килобаза. В момента методът на Сангер се използва в различни лаборатории, като цяло в съвременните му варианти. В допълнение се използва за потвърждаване на получените резултати с най-сложните техники - но по-малко прецизни.

Автоматично секвениране

Когато се изисква последователност в голям мащаб, процесът се ускорява чрез автоматизация. Това е вариант на метода за прекратяване на веригата на Сангер, при който праймерите са етикетирани с флуоресцентни продукти, за да се разграничат.

Впоследствие, реакционният продукт се провежда в електрофореза - всичко това в една лента. Тъй като всеки фрагмент излиза от крайната част на гела, той бързо се идентифицира по флуоресцентното му етикетиране с грешка около 1%.

Най-сложните системи имат система до 96 капилярни тръби, управлявана от компютър, свързан с робот. Тоест, 96 ДНК проби могат да бъдат тествани едновременно. По този начин процесът, включващ електрофореза и анализ на резултатите, е напълно автоматизиран.

За един ден тези системи могат да секвенират до 550 000 бази. По време на процеса човешкият труд е ненужен, отнема само около 15 минути, за да стартирате метода.

Максим-Гилбърт последователност

В същото време, когато Сангер публикува своята работа, двама изследователи на име Алън Максан и Уолтър Гилбърт успяват да разработят друг метод за получаване на ДНК последователността. Методът придоби популярност по това време, но по-късно бе изместен от усъвършенстването на метода на Сангер.

Противно на метода на Сангер, секвенцирането на Максан и Гилбърт (или химичното секвениране, както е известно също) не включва реакции на хибридизация. Методиката се състои в етикетиране с реактивни агенти в единия край, последвано от процес на пречистване.

Един от негативните страни на тази техника се крие в огромната й сложност и в използването на химикали, които са опасни за потребителя. Химическите разкъсвания се индуцират от прилагането на DMS, мравчена киселина, хидразин и хидразин със соли.

процес

Протоколът започва с етикетирането в 5 'края на нишката с фосфорния маркер 32, след това настъпва химическа модификация на азотната основа и тя се отделя. Накрая се случва разцепването на абазичния регион.

Първо съкращавате низ, който искате да секвенсирате в по-малки сегменти. Тази стъпка се извършва с рестрикционни ензими, които водят до изпъкнали краища.

След това реакцията се провежда с алкална фосфатаза, чиято цел е да се елиминира фосфатната група. По този начин полинуклеотидна киназа може да се използва за извършване на етикетирането.

Веригата е денатурирана (двете нишки са отворени). Тогава се прилагат химикалите. Тези реакции на разцепване се извършват контролирано и е известно какви видове връзки се прилагат при всяко химическо разкъсване.

Четене на резултатите

Както при метода на Сангер, четенето на резултатите включва разделяне по размер на веригите, получени в електрофорезна система. Системите, съставени от полиакриламид, позволяват да се получи много адекватна разделителна способност за отчитане на гела.

Масова последователност

Масивното секвениране обхваща поредица от нови методи, съкратено като NGS, от английския “Next Generation Sequisting”.

Методите, класифицирани като NGS, изискват предходен етап на амплификация на ДНК (те не работят с една молекула). Освен това използваните платформи варират значително. Принципите на най-популярните методи ще бъдат описани по-долу:

Пиросеквениране

Тя включва наблюдение на освобождаването на пирофосфат, което се случва всеки път, когато към нишката на ДНК се добави нов нуклеотид. Система от ензими е свързана, така че излъчването на светлина (което се открива с камера) се случва всеки път, когато се включи нов нуклеотид.

Процесът започва с отделната инкубация на всяка азотна основа, за да се провери дали има или няма светлинно излъчване. Пиросеквенцията може да чете дълги направления, но честотата на грешките е висока.

Синтезно секвениране

Това включва включването на белязани нуклеотиди. Тези флуоресцентни компоненти се добавят, промиват и се отбелязва включеният нуклеотид. След това нуклеотидният етикет се отстранява и синтезата на нишката може да продължи. В следващия етап ще бъде включен белязан нуклеотид и горепосочените стъпки ще бъдат повторени.

Недостатък на тази техника се получава, когато флуоресцентните маркери не бъдат премахнати напълно. Тези емисии създават основни грешки, което води до значителни грешки.

Последователност на лигиране

Тази техника се различава от останалите, тъй като не използва ДНК полимераза. Вместо това ключовият ензим за тази методология е лигазата. Тук се използват флуоресцентно маркирани фрагменти на ДНК, тя е свързана от ензима и се открива.

Най-големият проблем при тази техника е късата дължина на фрагмента, която е способна да обработи.

Ионно секвентиране на торен

Тази техника се основава на измерването на Н ⁺ йона, който се освобождава при всяко включване на нов нуклеотид. Принципът е доста подобен на пиросеквенцията, но много по-евтин.

Примери

Последователността на човешкия геном

Последователността на човешкия геном беше едно от най-обещаващите предизвикателства в биологията, както и едно от най-аплодираните съперници в историята на науката. Всъщност за учените, участващи в проекта, последователността на генома се превърна в конкуренция.

През 1990 г. той започва така наречения „проект за човешкия геном“, ръководен от известния учен, носител на Нобелова награда Джеймс Уотсън. След една година, през 1991 г., Вентер поема предизвикателството да "победи" Уотсън и да секвенира генома пред себе си. Въпреки това през 1992 г. Уотсън се пенсионира и командата е поета от друг изследовател.

През 1995 г. Вентър обявява успеха си в пълното секвениране на бактериален геном чрез метода на произволно секвениране. По същия начин противниковият екип обяви година по-късно секвенирането на генома на дрождите.

През 2000 г. дипломата е прекратена. И двете компании публикуваха своите предварителни резултати от целия геном в две от най-престижните списания на Science: Nature and Science.

Учените обаче продължиха да работят за подобряване на предложенията и през 2006 г. последователностите на определени човешки хромозоми бяха завършени.

Значение и приложения

Познаването на реда на нуклеотидите на такава важна молекула като ДНК е ценно за биолозите и свързаните с тях специалисти. Тази верига от полинуклеотиди съдържа цялата информация, необходима за развитието и поддържането на всички форми на живот.

Поради тези причини познаването на тази последователност е от съществено значение за биологичните изследвания. По принцип секвенирането дава възможност да се измери едно от най-важните свойства на биологичните системи и да се установят различия между тях.

Секвенирането се използва широко от таксономисти и систематисти, тъй като някои последователности на ДНК позволяват да се установят критерии за заключение дали два организма принадлежат към един и същи вид, в допълнение към това, че могат да предложат хипотези за филогенетичните връзки между тях.

Освен това, ДНК секвенирането има приложения в медицината и диагностиката. Например, има евтини и достъпни системи, които чрез секвениране дават възможност да се оцени тенденцията за развитие на определени заболявания (като рак), използвайки така наречените единични нуклеотидни полиморфизми (SNPs).

Разследванията от криминален и криминалистичен тип също са обогатени с техники за секвениране, които могат да бъдат използвани като надеждни доказателства за участието на определено лице в престъпление.

Препратки

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). Последователността на секвенсори: историята на секвениране на ДНК. Геномика, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013). Революцията на следващото поколение на последователността и нейното въздействие върху геномиката. Клетка, 155 (1), 27-38.
3. Леви, Дж. (2010). Научни съперничества. От Галилео до проекта за човешкия геном. Редакция Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, AR (1977). ДНК секвениране с верижни крайни инхибитори. Трудове на Националната академия на науките, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Поредното поколение последователност трансформира днешната биология. Природни методи, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (Ed.). (2014). Следващо поколение секвениране. Caister Academic Press.