ОЦВЕТЯВАНЕ С ХЕМАТОКСИЛИН-ЕОЗИН: ХАРАКТЕРИСТИКИ, ПРИЛОЖЕНИЯ, ТЕХНИКИ - ХИМИЯ - 2025

В хематоксилин - еозин е техника за оцветяване, като се използва комбинацията на хематоксилин и еозин на багрила. Този чифт багрила прави перфектен дует, тъй като хематоксилинът действа като основно багрило, а еозинът е кисело багрило.

Обозначаването на основни или киселинни багрила не се отнася до рН, получено в разтвор, а по-скоро говори за преобладаващото съотношение по отношение на анионните или катионните заряди, които притежават, или според местоположението на хромофорната група.

Хематоксилин - еозин (HE) оцветен ресничен колонен епител Източник: Тод Строс и Владимир Осипов

В този смисъл хематоксилинът се счита за основно (катионно) багрило и следователно има афинитет към киселинни структури, като ядрото на клетките. Докато еозинът, бидейки киселинно (анионно) багрило, има афинитет към алкални или основни структури, като клетъчна цитоплазма.

Поради тази причина тази комбинация от багрила се използва широко за оцветяване на тъканите, тъй като позволява ясно да се разграничат ядра и цитоплазми. Ядрата оцветяват тъмносиньо или лилаво, а цитоплазмата е розова.

Оцветяването с хематоксилин-еозин е една от най-използваните техники за оцветяване в областта на хистологията и цитологията, поради лесното им боравене и ниската цена. Използва се за визуализиране на клетки, дебели нервни влакна и наличието на определени микроорганизми в тъканите, като: паразити, гъбички и бактерии, между другото.

характеристики

хематоксилин

Хематоксилинът е неутрално багрило. Компонентът, който осигурява цвета (хромофор), обаче е разположен в катионния или основен център на молекулата. Оттук и нейният афинитет към киселинните структури. Химичната му формула е C ₁₆ H ₁₄ O _6, а научното му наименование е 7,11b-дихидроидено хромен-3, 4,6a, 9,10 (6 H) -пентол.

Оцветява главно ядрата на клетките, тъй като те са много богати на нуклеинови киселини. Освен това може да оцвети цитоплазмени включвания с вирусен произход.

За да може хематоксилинът да се оцвети, той трябва да бъде в окислено състояние и свързан с метал. Последният ще служи за фиксиране към тъканта, тоест ще действа като мордант.

Когато хематоксилинът се окислява, той се нарича хематеин. Окисляването се постига чрез излагане на кислород (стареене) на реагента или от вещества, които спомагат за неговото окисляване (химическо окисляване).

еозин

Eosin е багрило, което оцветява червено или розово. Той е неразтворим във вода, въпреки че има водоразтворима версия. Обикновено еозинът се приготвя чрез разтваряне в алкохол (95 ° етанол).

Оцветява цитоплазмите, мускулните влакна, цитоплазмените органели и колагена, но не оцветява клетъчните ядра. Това е така, защото е отрицателно зареден, следователно има афинитет към положително заредените структури.

Има два вида еозин "Y" и "B". Eosin "Y" е известен като жълт еозин. Научното му наименование е тетрабромо флуоресцен, а химическата му формула е C ₂₀ H ₈ Br ₄ O ₅.

От друга страна, еозинът "В" понякога се нарича синкав еритрозин Б. Научното му наименование е дибромодинитро флуоресцеин, а формулата е C ₂₀ H ₈ Br ₂ N ₂ O ₉. И двете са много сходни и разликата между използването на едно или друго не е наистина забележима. Въпреки това, най-популярният е еозин "Y".

Eosin има свойството да прави разлика между жива и мъртва клетка, тъй като е способен само да пресече мембраната, за да оцвети цитоплазмата й, когато клетките са мъртви, оставяйки цитоплазмата на клетката безцветна, ако остане жива.

Приложения

Оцветяване на нервните влакна

Плътните нервни влакна могат да бъдат оцветени и идентифицирани с хематоксилин-еозин. Това обаче не е полезно за оцветяване на тънки нервни влакна, тъй като за визуализиране на последните е необходимо сребърно оцветяване.

Хистологични петна по кожата

При оцветяването на роговия слой на кожата багрилото, което действа, е еозин, тъй като на това ниво клетките нямат ядро.

В гранулирания слой на кожата хематоксилинът оцветява силно кератохиалиновите гранули вътре в гранулиращите клетки. Напротив, спинозният слой на кожата е слабо оцветен с хематоксилин, докато основният или зародишният слой е доста оцветен.

Еозин оцветява цитоплазмата на всички клетки и интензитетът на цвета може да варира от слой до слой.

Оцветяване на хематоксилин-еозин на проби от изпражнения

Gómez et al., През 2005 г. демонстрира, че оцветяването на хематоксилин-еозин е по-ефективно при идентифициране на случаи на амебиаза, дължащи се на Entamoeba histolytica и Entamoeba dispar, отколкото на метода за прясна визуализация (физиологичен разтвор и лугол) при пациенти с остра диариална болест.

Показано е също така, че е много чувствителен при откриване на еритрофагоцитоза (амеби, които са обхванали еритроцитите).

Оцветяване на хистологични секции за диагностициране на инфекция

Walwyn et al., През 2004 г. предложиха използването на хистологични петна за откриване на микроорганизми, причиняващи инфекция.

Използвайки оцветяване с хематоксилин-еозин, те успяха да визуализират инфекции, причинени от Clostridium, Actinomyces, спирили или Candida. Те също бяха в състояние да наблюдават присъствието на паразита Sarcoptes escabiei в кожни участъци и вирусни включвания от цитомегаловирус и херпес в участъци от различни тъкани.

техники

За хистологични проби

Оцветяването на хистологичното сечение преминава през серия от стъпки. Първото нещо е да се получи хистологичното сечение. Това трябва да се намаже с восък, за да се получат по-късно разрезите (ултра фини) с микротом. Техниката се състои от следните стъпки:

1-Елиминиране на излишния парафин: за това можете да използвате ксилол или Heme-D, потапяйте за 3-5 минути.

2-Рехидратация на пробата: това се постига чрез потапяне на пробата в различни концентрации на алкохоли (етанол) в низходящ ред (100 °, 90 °, 70 °). Във всички случаи за 7 минути.

3-Елиминиране на излишния алкохол: за това той се потапя във вода за 7 минути.

4-Оцветяване с хематоксилин: пробата се потапя за 6-10 минути в тава, съдържаща хематоксилин. Времето на експозиция зависи от размера и дебелината на пробата.

5-Елиминиране на излишния хематоксилин: измива се с вода в продължение на 5 минути и след това се извършва бързо преминаване (10-20 секунди) чрез кисел алкохол. По-късно се измива отново с вода за 5 минути. След това се потапя в етанол при 96 ° С за 1 минута.

6-Оцветяване с еозин: за това пробата се потапя за 5 минути в тавата с еозин.

7-Дехидратация на пробата: за да направите това, тя преминава през тавите с алкохол (етанол), но този път във възходящ ред. (70 °, 90 °, 100 °). (За съответно 5 секунди, 5 секунди, 1 минута).

8-Изясняване на пробата: за това тя се излага на ксилол за 5-10 минути и се изсушава, за да се запечата за постоянно с балсам от Канада или друг подобен материал.

За проби от изпражненията търсите

Намазва се върху слайд с изпражненията на пациента и се фиксира с 80% алкохол за 5 минути. Листът се потапя в хематоксилин за 5 минути и веднага се промива с вода.

Впоследствие той бързо се потапя в кисел алкохол и след това в амонячна вода. Измива се с вода. Оцветен е за 5 минути в еозин. Пробата се дехидратира, както е обяснено в предшестващото състояние на техниката и накрая се изплаква с ксилол.

Приготвяне на реагенти

- Хематоксилин

В един литър дестилирана вода се разтварят 50 грама калиев или амониев алуминиев сулфат. Когато се разтвори напълно, добавете 1 грам кристализиран хематоксилин. При пълно разтваряне се добавя 1 g лимонена киселина заедно с 50 g хлорален хидрат и 0,2 g натриев йодат.

Сместа се вари в продължение на 5 минути, след това се оставя да се охлади и се филтрира, за да се отстранят всички останали твърди частици. Така приготвеният реагент може да се използва веднага.

- Еозин

Може да се приготви с алкохолна основа или с водна основа.

Алкохолен еозин

В 100 ml етанол при 95 ° се разтварят 0,5 грама еозин "Y". След това добавете няколко капки ледена оцетна киселина.

2% воден еозин

В 1250 мл дестилирана вода се разтварят 25 грама водоразтворим еозин "Y". След това добавете няколко капки ледена оцетна киселина.

Киселен алкохол

Измерете 0,5 ml концентрирана солна киселина и допълнете до 100 ml с абсолютен алкохол.

Амонячна вода

Измерете 0,5 ml концентриран амоняк и допълнете до 100 ml с дестилирана вода.

Препратки

1. Наварете, Г. Хистология на кожата. Rev Fac Med UNAM 2003; 46 (4): 130-133. Достъпно на: medigraphic.com
2. Gómez-Rivera N, Molina A, García M, Castillo J, Castillo J, García R, Fonseca I, Valenzuela O.
3. Идентификация на Entamoeba histolytica / E. Диспарирайте се чрез техниката с прясна амеба и нейното оцветяване с хематоксилин-еозин при остра диария. Rev Mex Pediatr 2005; 72 (3); 109-112. Достъпно на: medigraphic.com
4. Walwyn V, Iglesias M, Almarales M, Acosta N, Mera A, Cabrejas M. Полезност на хистологичните техники за диагностициране на инфекция в анатомични образци. Rev Cub Med Mil, 2004; 33 (2). Достъпно на: scielo.sld
5. PanReac AppliChem ITW Reagents. Петна от хематоксилин-еозин. 2017, Испания. Достъпно на: itwreagents.com
6. Еозин. Уикипедия, Свободната енциклопедия. 7 ноември 2018 г., 08:18 UTC. 4 август 2019, 22:13 en.wikipedia.org
7. "Хематоксилин." Уикипедия, Свободната енциклопедия. 3 май 2019 г., 11:23 UTC. 4 август 2019, 22:48 wikipedia.org