КАТАЛАЗЕН ТЕСТ: ОБОСНОВКА, ТЕХНИКА И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЯ - 2025

В теста каталаза е методология, използвана в бактериология лаборатории, за да разкрие присъствието на ензима каталаза в тези бактерии, че притежават. Заедно с оцветяването по Грам, те са основните тестове, които трябва да бъдат извършени върху новоотделени микроорганизми. Тези тестове насочват микробиолога към стъпките, които следва да следва за окончателното идентифициране на въпросния микроорганизъм.

По принцип бактериите, съдържащи цитохром, притежават ензим каталаза, което означава, че факултативните аеробни и анаеробни бактерии трябва да го притежават. Има обаче и изключения, като стрептокок, който въпреки факултативните анаеробни микроорганизми, не притежава ензимната каталаза.

Изпълнение на каталазния тест, показва положителна реакция. Източник: Не е предоставен машинно четим автор. Предполага се Nase (въз основа на претенции за авторски права)

Ето защо каталазният тест се използва главно за разграничаване на семействата на Staphylococaceae и Micrococaceae (и двете каталазни положителни) от семейството Streptococaceae (отрицателно за каталаза).

По същия начин родът Bacillus (каталаза положителен) се отличава от рода Clostridium (каталаза отрицателен), наред с други.

основа

Каталазата е ензим, класифициран като хидропероксидаза, това означава, че те използват водороден пероксид (H ₂ O ₂) като субстрат.

Освен това се счита за оксидоредуктаза, тъй като в реакцията, в която участва, има елемент, който служи като донор на електрон (редуциращо вещество) и друг като електронен рецептор (окисляващо вещество).

Каталазата е протеин, който съдържа прорикова група с четири тривалентни железни атома (Fe ⁺⁺⁺), следователно е хомопротеин. Железният йон остава окислен по време на реакцията.

Може да се каже, че каталазата е детоксикиращ ензим, тъй като нейната функция е да елиминира вещества, които се произвеждат по време на бактериален метаболизъм, които са токсични за бактериите. Сред тези вещества е водородният пероксид.

Водородният пероксид се образува от разграждането на захарите аеробно. Този процес протича по следния начин:

Супероксиден йон (О ₂ ^-) (свободен радикал) е оформен като краен продукт на усвояването на глюкоза от аеробни маршрута. Това е токсично и се елиминира от ензима супероксид дисмутаза, който го превръща в газообразен кислород и водороден пероксид.

Водородният пероксид също е токсичен за бактериите и трябва да бъде отстранен. Ензимната каталаза разгражда водородния пероксид до вода и кислород.

Каталазата може да действа върху субстрати, различни от водороден пероксид, като алкохоли, алдехиди, киселини, ароматни амини и феноли. Обаче водородният пероксид може да се използва и от каталаза за окисляване на други токсични съединения като метилов и етилов алкохол.

По същия начин каталазата присъства във фагоцитните клетки, предпазвайки я от токсичното действие на водородния пероксид.

Рутинна техника за тест на каталаза

-Плъзгащ метод

материали

3% водороден пероксид (10 обема).

Микроскопски слайд

Пластмасова дръжка за еднократна употреба или дървена клечка за зъби.

процес

Вземете достатъчно от колонията, за да проучите, без да докосвате агара, от който е дошъл. Колонията трябва да е прясна, тоест от култура от 18 до 24 часа.

Поставете колония на сух шейна и се добавя една капка от 3% водороден прекис, за да го (30% H ₂ O ₂ може да се използва). Наблюдавайте веднага дали се отделят или не мехурчета.

Интерпретация

Положителна реакция: отделяне на газ, доказано чрез образуването на мехурчета (силно барботиране).

Отрицателна реакция: няма образуване на мехурчета

- Директен метод в чистата култура

Поставете 1 ml 3% H ₂ O ₂ върху чиста чиния или клинова култура, която не съдържа кръв (за предпочитане хранителен агар). Наблюдавайте дали има образуване на мехурчета веднага или не. 30% H ₂ O ₂ също може да се използва.

Интерпретира се същото като метода на порталния обект.

-Метод с капилярна тръба или Fung и Petrishko

Напълнете 67 mm капилярна тръба до височина 20 mm с 3% водороден пероксид по капилярност.

Докоснете изолираната колония, която ще бъде изследвана, с капиляра, напълнен с 3% H ₂ O ₂ . Наблюдавайте дали капилярът се запълва с мехурчета за приблизително 10 секунди. Този метод позволява полу-количествено определяне на реакцията в кръстове:

Без кръстове няма мехурчета (отрицателна реакция).

+ ---- Малко мехурчета (слаба или забавена реакция).

++ --– Обилни мехурчета (умерена реакция).

+++ - Мехурчетата достигат до противоположния край (силна реакция).

-Тейлър и Аханзар метод за каталазни тестове, които дават съмнение

Поставете изолирана колония върху чист, сух слайд, след това поставете капка от 0,5% H ₂ O ₂ и покрийте с капак. Наблюдавайте дали има или не образуване на хванати мехурчета.

Тълкуване: наличието на мехурчета показва положителна реакция. Без мехурчета, това се интерпретира като отрицателна реакция.

Каталазен тест за видове Mycobacterium

Тази техника трябва да се извърши чрез контролиране на рН и температура. Той трябва да се извърши под капак на ламинарен поток, тъй като манипулирането на различните видове Mycobacterium е опасно.

-Materials

Водороден пероксид 30% или 110 обема (супероксал).

Фосфатен буфер pH 7

10% Tween 80

Микобактериална клинова култура за 3 до 4 седмици

-Изготвяне

Фосфатен буфер pH 7

За да се претегля:

1.361 g безводен монокалиев фосфат (KH ₂ PO ₄).

1.420 g безводен динатриев (Na2HPO3) фосфат.

И двете соли се разтварят в малко стерилна дестилирана вода и се допълват до 1000 ml с вода.

10% Tween 80

Направете разреждане в съотношение 1:10 на Tween 80, който е търговско концентриран, за да направите това по следния начин:

Вземете 1 ml Tween 80 и го поставете в малко дестилирана вода, разтворете и след това допълнете обема с вода до 10 ml.

Краен реагент

Смесете количество фосфатен буфер с количество от 10% Tween 80 (равни части). Определете в лабораторията колко искате да подготвите.

-Process

Поставете 5 ml фосфатен буфер в стерилна епруветка с капачка (бакелит).

С инокулационен контур вземете достатъчно колония от растеж на Mycobacterium, засята в клинове и разтворете във фосфатния буфер.

Затворете тръбата без да затягате резбата. Поставете във водна баня при 68 ° C в продължение на 20 до 30 минути. Извадете и оставете да се охлади до 22-25 ° C

Измерете 0,5 ml от крайния реагент (смесете) и го добавете в епруветката със студения разтвор. Наблюдавайте образуването или не на мехурчета.

Тълкува се същото като предишните техники.

употреба

Когато растежът на колониите се получи в обогатена среда, върху получените колонии трябва да се извърши оцветяване по Грам и тест на каталаза. Това ще насочи микробиолога относно процедурите, които да следва за окончателно идентифициране.

Източник: Подготвено от автора MSc. Мариелса гил

QA

За да се оцени доброто представяне на реагента на водороден пероксид, се използват прясно култивирани контролни щамове, като Staphylococcus aureus като положителна контрола и Streptococcus sp щамове като отрицателна контрола.

Друга алтернатива, която служи като положителен контрол, е поставянето на капка водороден пероксид върху кръвния агар, еритроцитите имат каталаза, следователно, ще има барботиране, ако реагентът е в добро състояние.

Като отрицателна контрола може да се използва шоколадов агар, тук еритроцитите вече са лизирани и тестът е отрицателен.

Ограничения

-Не използвайте стари култури за теста, тъй като това може да доведе до фалшиви негативи.

-Избягвайте вземането на колонии от култури върху кръвен агар, ако внимавате да не докоснете агара; Тази процедура може да доведе до фалшиви положителни резултати, тъй като червените кръвни клетки съдържат каталаза.

-Ако вземете колонията с платинена дръжка, не обърнете реда на процедурата, защото това може да генерира фалшиви позитиви. Това е така, защото платината е в състояние да реагира с водороден прекис, причинявайки бълбукане.

-Не използвайте реагента на водороден прекис, ако е много стар, тъй като реагентът е много нестабилен и има тенденция да се разлага с течение на времето.

-Задържайте реактива на водородния пероксид, защитен от светлина и хладилник, за да предотвратите повреда.

-Извършете качествен контрол на реагента на водороден пероксид всеки път, когато се използва.

-Вземете предвид, че ако се използва 30% H ₂ O ₂, реакциите са по-силни от тези, проведени с 3% H ₂ O ₂.

Препратки

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологична диагноза. 5-то изд. Редакция Panamericana SA Аржентина.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Микробиологична диагностика на Бейли и Скот. 12 изд. Редакция Panamericana SA Аржентина.
3. Mac Faddin J. (2003). Биохимични тестове за идентифициране на бактерии с клинично значение. 3-то изд. Редакция Panamericana. Буенос Айрес. Аржентина.
4. BD Laboratories. Каталаза-Готарио реагент. Достъпно на:
5. Vadequímica Laboratories. Кислородна вода. Еквивалентност между обеми и процент. Достъпно на: vadequimica.com