ОКСИДАЗЕН ТЕСТ: ОБОСНОВКА, ПРОЦЕДУРА И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЯ - 2025

В теста оксидаза е диагностичен метод, който показва присъствието на ензимен комплекс, наречен цитохром оксидаза в. Тази система индуцира трансформацията на цитохром, редуцирана до окислена, тъй като тя улавя кислорода и това от своя страна действа като последния акцептор на електрон (Н ⁺) в дихателната верига.

Терминът оксидаза е съкратен начин за обозначаване на ензима цитохром оксидаза, известен още като индофенолоксидаза. В древни времена се е смятало, че ензимите цитохром оксидаза и индофенолоксидаза са два различни ензима, но днес се знае, че са едни и същи.

Положителен и отрицателен тест за оксидаза. Източник: Не е предоставен машинно четим автор. Alpha.prim ~ commonswiki приета (въз основа на претенции за авторски права).

От своя страна, цитохромите са хемопротеини, които съдържат желязо и завършват цитохром оксидазната система. Цитохромите могат да варират от видове до видове.

Има различни разновидности на цитохромите (цитохроми a1, a2, a3 и 0). Някои бактерии могат да произведат само една, но други до две или три наведнъж. В този смисъл присъствието на цитохром a и a3 е известно като цитохром оксидаза c. Това е типът цитохром, който оксидазният тест открива.

Родовете Neisseria и Pseudomonas съдържат цитохром оксидаза c. Тези родове дават положителния тест за оксидаза, като помагат да се разграничат съответно от родовете Acinetobacter и Stenotrophomonas.

Има и други родове, които са положително оксидаза.

основа

Характеристики на системата цитохром оксидаза с

Системата на цитохром оксидаза с работи по следния начин: микроорганизмите, положителни за оксидаза, използват кислород за генериране на енергия чрез аеробно дишане. Тази система работи благодарение на транспортирането на електрони от донорски вещества като NADH ⁺ до рецепторни вещества, в случая кислород.

Това води до производството на енергия (АТФ) и вода или водороден пероксид, в зависимост от цитохром оксидазната система, която микроорганизмът притежава.

Ето защо повечето от положителните към оксидазата бактерии са също положителни от каталаза, необходимо условие за елиминиране на произведения водороден пероксид, тъй като това вещество е токсично за бактериите.

Системата на цитохром оксидаза с присъства в някои аеробни бактерии, някои факултативни анаероби, малко микроаерофилни такива и няма строги анаероби. Последното е разбираемо, тъй като строгите анаероби не могат да живеят в присъствието на кислород, поради което им липсва цитохром оксидазната система.

Принцип на изпитване

В този тест той използва вещества, които действат като изкуствени акцептори на електрон, замествайки естествените такива в електронната транспортна верига.

Основно се използват багрила като парафенилендиамин и индофенол, които действат като рецепторни субстрати и изкуствени донори на електрон.

Парафенилендиаминът се окислява от системата на цитохром оксидаза с. Багрилото в намалената му форма е безцветно, но в окислената си форма е оцветено.

Ето как се доказва наличието на системата на цитохром оксидаза с; тъй като положителната реакция ще генерира цвят от лавандула или синьо-лилаво в зависимост от използвания реагент.

От друга страна, ако последното приемане на електрон в дихателната верига е различно от кислорода, тестът за оксидаза ще бъде отрицателен (няма оцветяване); такъв е случаят с анаеробните микроорганизми.

По същия начин, ако цитохромът, използван от микроорганизма, е различен от цитохром оксидазата с, той също ще даде отрицателния тест.

процес

Има различни реагенти и протоколи за теста за оксидаза, всички с една и съща цел.

Реагенти

Реактив на Kovacs, реактив Гордън и Маклеод, реагент Нади, Карпентер, Сурланд и Морисън и използване на оксидазни дискове.

-Ковакс оксидазен реагент

Съставен е от 1% тетраметил-р-фенилендиамин дихидрохлорид.

Реактивът на Kovacs се приготвя чрез разтваряне на 1 g от гореспоменатото вещество в 50 ml дестилирана вода. Загрява се долно, докато се разтвори напълно. Прехвърлете в кехлибарена бутилка с достатъчен капацитет и допълнете обема до 100 ml с дестилирана вода. Изчакайте поне 15 минути преди да използвате. Да се ​​съхранява в хладилник, защитено от светлина.

Той е обозначен като реактив на Kovacs оксидаза, за да го разграничи от реактива на Kovacs, използван за разкриване на индоловия тест. Този реагент е най-чувствителният, по-малко токсичен, но по-скъп от останалите реагенти.

Положителна реакция ще бъде показана с този реагент с промяна на цвета на колонията на лавандула, която бързо се превръща в лилаво почти черно. Отрицателна реакция е очевидна, тъй като в колонията няма промяна на цвета или тя придобива лек розов цвят. Средата също може да потъмнее, но това не означава положителна реакция.

При този реагент времето за реакция е от решаващо значение, промяната на цвета, която настъпва между 5 до 15 секунди, се счита за положителна реакция.

-Гордън и реактор Маклауд

Съставен е от диметил-р-фенилендиамин дихидрохлорид, известен още като N-диметил-р-фенилендиамин или р-аминодиметиланилин монохидрохлорид. Той се приготвя, както е описано за реактива на Kovacs оксидаза, заместващ съответното вещество.

Този реагент е малко по-стабилен от реактива на Kovacs оксидаза, въпреки че всички реагенти, съдържащи р-фенилендиамин, са нестабилни.

Тази реакция е по-късна, тя се интерпретира като положителна с появата на синьо-лилав цвят в рамките на 10 до 30 минути.

-Нади реагент

Състои се от 1% α-нафтол в етилов алкохол (95% етанол) и 1% аминодиметиланилин. Сместа се приготвя на равни части и като се използва абсолютен етилов алкохол като разредител, докато се получи достатъчно количество за 100 ml.

-Раптер, Сурланд и Морисън реагент

Състои се от 1% р-аминодиметилаланин оксалат. Пригответе се по същия начин, както е описано за реактива на Kovacs оксидаза, като промените за съответното вещество.

С готовия разтвор тестовите ленти се приготвят, както следва: 6-8 см филтри за хартия №1 филтърна хартия се импрегнират с 1% диметил-р-фенилендиамин оксалатен реагент.

Оставят се да изсъхнат без контакт с метал, съхраняват се в затварящи се винтове с десикант и съхраняват в хладилника. Тези ленти са стабилни до 6 месеца.

Той е най-стабилният реагент от всички споменати и може да издържи до 6 месеца в разтвор. Друг плюс е, че не оцветява средата около колонията, ако се използва директно върху чинията.

Появата на червен цвят се интерпретира като положителен тест.

-Оксидазни дискове

Те са търговски дискове, които са импрегнирани с реагент за оксидазния тест. На пазара има няколко търговски марки.

Използването му е доста практично, тъй като не е необходимо да се приготвят пресни реагенти, което улеснява работата. Получените резултати са надеждни, стига дисковете да бъдат запазени правилно.

протоколи

Метод с директна плоча, индиректен метод върху хартия и използване на дискове, импрегнирани с оксидазни реагенти.

- Метод на директната дъска

2 или 3 капки от някой от гореспоменатите реагенти се добавят за тази цел директно върху колонията (ите), съдържаща се в плоча с хранителна среда, която не съдържа глюкоза.

Промяната или не на цвета на колониите се тълкува, а не на средата. Валидното време за реакция зависи от използвания реагент.

-Неизмерен метод на хартия

Нарежете парче филтърна хартия (Whatman № 1) на размер 6 см ² и го поставете вътре в празен съд на Петри.

Добавете 2 или 3 капки от реактива на Kovacs оксидаза към хартията, вземете част от колонията, която ще се изследва, с платинена дръжка или дървена клечка за зъби и я разстелете в права линия върху импрегнираната с реагент хартия. Интерпретирайте в рамките на 5 до 10 секунди.

С лентите, приготвени с реактив Carpenter, Suhrland и Morrison, върху сухата лента се разстила колония. Една лента се използва за тестване на няколко щама. Интерпретирайте след 10 сек.

-Дискове (m

Навлажнете тънко търговските дискове със стерилна дестилирана вода и наслагвайте върху колонията, която ще се изследва. Препоръчва се използването на плочите при 35 ° C, ако се използват плочи със стайна температура или хладилни чинии, реакцията е малко по-бавна. Интерпретирайте промяната на цвета между 10 до 20 сек.

Могат да се използват колонии, съдържащи се в кръв или шоколадов агар.

-Дискове (непряк метод)

Навлажнете диска, както е описано по-горе. Поставете го в празен съд на Петри. Вземете достатъчно количество от колонията за изследване с платинена дръжка или дървена клечка за зъби и поставете върху диска. Интерпретирайте промяната на цвета между 10 до 20 сек.

употреба

Родът Neisseria и Acinetobacter понякога са много сходни морфологично, защото въпреки че родът Acinetobacter е грамотрицателен прът, той понякога може да приеме кокцидна форма и да бъде разпределен по двойки, симулирайки рода Neisseria.

В този случай тестът за оксидаза е наистина полезен. Родът Neisseria е положителен, а Acinetobacter отрицателен.

Родът Moraxella обаче е много подобен на род Neisseria и двамата дават положителна реакция; Ето защо тестовете за ферментация на въглехидрати трябва винаги да се провеждат за окончателно идентифициране.

От друга страна, тестът за оксидаза е полезен за разграничаване на бактерия, принадлежаща към семейство Enterobacteriaceae (всички оксидазни отрицателни) от други ферментатори, като рода Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (положителна оксидаза).

Родът Vibrio и Helicobacter също са положителни към оксидазата.

QA

Използвайте известни щамове на Escherichia coli като отрицателна контрола и щамове на Pseudomonas aeruginosa като положителна контрола.

Ограничения

-Реагентите трябва да се използват прясно приготвени, срокът им на годност в разтвор при стайна температура е кратък, защото са много нестабилни. В хладилник те могат да издържат от 5 дни до 2 седмици.

-Реагентите са безцветни, ако променят цвета си, те трябва да бъдат изхвърлени. Повредените дискове се появяват, защото с времето потъмняват.

-Положителната реакция с реактива на Kovacs оксидаза между 15-60 s се счита за забавена реакция и след 60 секунди трябва да се счита за отрицателна.

-Haemophylus influenzae дава отрицателна оксидазна реакция, ако се използва реагент с диметил-р-фенилендиамин, но положителна, ако се използва реагентът на Kovacs оксидаза (тетраметил-р-фенилендиамин).

-Меди, съдържащи глюкоза, пречат на теста, давайки фалшиви негативи.

-Бордетела коклюш може да даде фалшива положителна реакция, ако идват от силно концентрирани плочи с кръвен агар.

-Употребата на метални (железни) дръжки дава фалшива положителна реакция.

препоръки

-Защото реагентите са много нестабилни и са склонни да се самоокисляват, се препоръчва да се замразят аликвоти от 1 до 2 ml и да се отстранят при необходимост.

-Друг начин за забавяне на автоокисляването на реагента е добавянето на 0,1% аскорбинова киселина при приготвянето на реагентите.

-Както реагентите са нестабилни, се препоръчва седмичен контрол на качеството.

-Регенти, които не преминат тест за контрол на качеството, не трябва да се използват.

Препратки

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологична диагноза. 5-то изд. Редакция Panamericana SA Аржентина.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Микробиологична диагностика на Бейли и Скот. 12 изд. Редакция Panamericana SA Аржентина.
3. "Оксидазен тест." Уикипедия, Свободната енциклопедия. 15 януари 2018 г., 10:32 UTC. 3 април 2019 г., 14:03
4. Световна здравна организация. Ръководство за лаборатория за идентифициране и тестване на чувствителност към антимикробни бактериални патогени от значение за общественото здраве в развиващия се свят 2004. Достъпно на: who.int/drugresistance/infosharing
5. Ленти с реагенти за диагностициране на оксидазната активност в бактериите. Rev Cubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150-151.