ФОСФАТЕН БУФЕР (PBS): ОБОСНОВКА, ПОДГОТОВКА И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЯ - 2025

На фосфатен буфер, фосфат-буфериран физиологичен разтвор или BPS е буфер изотоничен, чиято функция е да поддържа рН и осмотичното налягане най-близо до естествените биологични среда (физиологичен). Акронимът PBS означава буфер с фосфатен разтвор.

PH и осмоларността са два много важни аспекта, които трябва да бъдат контролирани в определени лабораторни протоколи. В случай на pH е важно да се контролира, особено при биохимични реакции, тъй като те могат да варират или да не се провеждат, ако реагентите са с неподходящо pH.

PBS фосфатно-буфериран физиологичен разтвор при две различни рН. Източник: Pixinio.com

Междувременно контролът на осмоларността е от съществено значение, особено когато се работи с живи клетки, тъй като плазмените мембрани на клетките реагират според концентрацията на разтворени вещества, в които те се намират.

Ако клетките се прехвърлят в хипертонична среда, те ще се дехидратират, тъй като водният градиент ще бъде транспортиран до страната, където има по-висока концентрация на разтворители. Ако, от друга страна, клетките се поставят в хипотонична среда, клетките ще абсорбират течност, докато не се лизират.

Ето защо PBS буферът се използва за лабораторни протоколи, които изискват поддържането на клетките in vitro, по този начин клетките няма да бъдат повредени.

PBS е съставен от комбинация от соли, като натриев хлорид, натриев фосфат, калиев хлорид и калиев фосфат. Съставът на PBS може да варира в зависимост от протокола.

основа

Основно функцията на фосфатния буфер е да поддържа постоянно физиологично pH заедно с концентрация на електролити, подобна на тази, намираща се в тялото.

В тази среда клетките са в състояние да останат стабилни, тъй като физиологичните условия се симулират възможно най-много.

Други съединения могат да бъдат добавени към първоначалния състав на PBS, ако е необходимо, например добавянето на EDTA към буфера е полезно за промиване на червени кръвни клетки при теста на кръстосана несъвместимост.

EDTA предотвратява фракцията на комплемент С1, присъстваща в серума, да се разцепва и лизира до червените кръвни клетки, тоест избягва фалшиви резултати от несъвместимост. В допълнение, EDTA помага за дисоциация на клетките.

подготовка

Количеството соли, което трябва да бъде претеглено за получаването на PBS фосфатно-буфериран физиологичен разтвор, ще зависи от количеството, което трябва да се приготви:

-Фосфатен буфериран физиологичен разтвор (10X PBS)

За един литър разтвор:

За да се претегля:

80,6 g NaCl,

2,2 g KCl, 11,5 грама на Na ₂ HPO ₄, 2.0 g KH ₂ HPO ₄

Техника на приготвяне

Поставете тежките соли в бехерова чаша, добавете достатъчно вода (80%) и разбъркайте върху бъркалката с магнитна лента, докато солите се разтворят.

Приготвяне на PBS с помощта на разбъркваща плоча с магнитна лента. Източник: Потребител: Ruhrfisch, Wikipedia. COM

Филтрирайте, за да премахнете неразтворените частици. Използвайте филтри с 0,45 µm пори. Автоклавирайте и разпределете асептично в качулка с ламинарен поток в стъклени буркани с капаци.

10X разтворът (концентриран) не регулира рН. Регулирането се извършва веднъж разредено до концентрация на 1X PBS буфер, (разреждане 1:10).

-Буфер фосфатен физиологичен разтвор (1X PBS)

1X PBS може да се приготви директно, като се претеглят съответните количества от всяка сол, или може да се приготви чрез разреждане на основния разтвор (1:10) със стерилна дестилирана вода.

-Пригответе директно един литър физиологичен разтвор с буфериран 1X PBS фосфат, претеглете:

8,06 g NaCl, 0,22 g KCl, 1,15 грама на Na ₂ HPO ₄, 0,20 g KH ₂ HPO ₄

Техника на приготвяне

Продължете както е обяснено в концентрирания разтвор. Впоследствие pH трябва да се регулира. За да направите това, измерете pH и в зависимост от резултата използвайте киселина (HCl) или основа (NaOH), за да понижите или повишите съответно pH, ако е необходимо, докато стане 7.4.

Киселината или основата се добавят капка по капка, докато се следи рН стойността на разтвора с помощта на рН метър. Филтрирайте, автоклавирайте и разпределете асептично в конусни тръби или буркани, ако е необходимо.

-Заготвяне на 1X PBS от 10X изходния разтвор:

Направете разреждане 1:10. Например, за да приготвите 1 литър 1X PBS, измерете 100 ml от основния разтвор и добавете 700 ml стерилна дестилирана вода. Регулирайте pH и напълнете количеството вода до 1000 ml.

Приготвеният PBS буфер е безцветен и прозрачен.

Ежедневно PBS може да се съхранява на стайна температура, а останалото в хладилника.

Решения за регулиране на pH

HCl

За 100 ml 1 моларен HCL (солна киселина).

Измерете 91 ml дестилирана вода и я поставете в 250-милилитрова чаша.

Измерете 8,62 ml концентрирана HCl и бавно я добавете в стъклената чаша, съдържаща водата (никога не правете обратното). Вземете подходящи мерки за биологична безопасност при работа със силни киселини (силно корозивно вещество).

Смесете в продължение на 5 минути, за предпочитане като използвате разбъркваща плоча с магнитна лента вътре в чашата. Прехвърляне на мл колба 100 и се долива до 100 мл с дестилирана Н ₂ O.

NaOH

За 100 ml NaOH (натриев хидроксид) 10 мола.

Измерете 40 ml дестилирана вода и я поставете в чаша от 250 ml. Измерете 40 g NaOH и добавете към водата. Смесете с помощта на бъркалка с магнитна лента вътре в чашата.

Прехвърлете в мерителна колба от 100 ml и допълнете до марката с дестилирана вода. Спазвайте разпоредбите за биобезопасност, тъй като тази реакция е екзотермична (освобождава енергия под формата на топлина).

Ако искате да приготвите други количества физиологичен разтвор на фосфат, можете да се консултирате със следната таблица:

Източник: «Лаборатория по вирусна и човешка геномия, Медицинско училище на UASLP»

Приложения

Използва се предимно в клетъчната биология, имунологията, имунохистохимията, бактериологията, вирусологията и изследователските лаборатории.

Той е идеален за измиване на клетки чрез центрофугиране (червени кръвни клетки), измиване на клетъчни монослоеве, в спектроскопски техники за елипсометрия, за количествено определяне на бактериални биофилми, за поддържане на клетъчни култури за вируси, като промивен разтвор в техниката на непряка имунофлуоресценция. и в техники за характеризиране на моноклонални антитела.

Използва се също за транспортиране на клетки или тъкани, като разредител за броене на клетките, приготвяне на клетъчни ензими (трипсин), като разредител за метода на изсушаване на биомолекулите и за приготвяне на други реагенти.

От друга страна, Мартин и др. През 2006 г. демонстрират, че PBS е полезен в съдебно-научните лаборатории, по-специално за възстановяване на сперматозоиди от вагинални намазки или за възстановяване на вагиналните клетки от петна. По този начин може да се установи дали е имало сексуална връзка.

Ограничения

-Някои PBS буфери съдържат вещество, наречено натриев азид като консервант. Това съединение може да генерира експлозивни вещества, ако влезе в контакт с олово или мед. Поради тази причина трябва да се внимава специално при изхвърлянето на този реагент в канала. Ако се изхвърли по този начин, трябва да се добави обилна вода, за да се разрежда до максимум.

-Цинкът не трябва да се добавя към фосфатния буфер, тъй като той причинява утаяване на някои соли.

-Wangen et al. През 2018 г. определят, че употребата на PBS не е подходяща за промиване на клетки на първична остра миелоидна левкемия (AML), извлечени от периферна кръв, поради факта, че много клетки се губят чрез лизис, с голям спад на материала протеин.

Следователно те определят, че първичните AML клетки не трябва да се промиват с PBS след съхранение в течен азот.

Препратки

1. Coll J. (1993). Диагностични техники във вирусологията. Ed Díaz de Santos. 360 pg
2. Rodríguez M, Ortiz T. Клетъчна култура. Промяна на среден. Катедра по нормална и патологична цитология и хистологичен университет в Севиля. Предлага се на personal.us.es
3. Получаване на фосфатно-буфериран физиологичен разтвор (PBS). (2008 г.). Стандартни оперативни процедури (SOPs) Лаборатория за човешка и вирусна геномия UASLP School of Medicine. Достъпно на адрес: genomica.uaslp.mx
4. "Фосфатен буфер физиологичен разтвор." Уикипедия, Свободната енциклопедия. 3 април 2019 г., 19:36 UTC. 13 април 2019, 02:57 en.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Теми в молекулярната биофизика. Достъпно на: users.df.uba.ar
6. Rediar. Ръчно. PBS + EDTA. Достъпно на: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Използването на фосфатно-буфериран физиологичен разтвор за възстановяване на клетки и сперматозоиди от тампони. Научно правосъдие. 2006; 46 (3): 179-84. Достъпно в: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A и др. Метод за съхранение и промиване с фосфатен солен разтвор влияят на острата миелоидна левкемия. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. Достъпно в: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). Теоретични и практически основи на хистохимията. Висш съвет за научни изследвания. Мадрид. Достъпно на адрес: books.google.co.ve