БУЛЬОН С КАРБАМИД: ОСНОВА, ПРЕПАРАТ И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЯ - 2025

В бульон урея е течна хранителна среда, се използва за откриване присъствието на уреаза ензим в определени микроорганизми. Уреазата е микробен ензим, който се произвежда конститутивно, тоест се синтезира независимо от това дали субстратът, върху който действа, присъства или не.

Функцията на уреазата е свързана с разлагането на органични съединения. Не всички микроорганизми са способни да синтезират този ензим, следователно неговото определяне в лабораторията позволява идентифициране на определени бактериални щамове и дори разграничаване между видовете от един и същи род.

Отрицателен и положителен тест за карбамид. Източник: Снимка, направена от автора MSc. Мариелса Гил.

Има два вида тест за карбамид: Stuart и Christensen. Те се различават по състав и чувствителност. Първият е специален за показване на голямо количество уреаза, произведена от видове от рода Proteus.

Вторият е по-чувствителен и може да открие малки количества уреаза, генерирана късно от други бактериални родове, като Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter и Mycobacterium.

Уреовият бульон на Stuart се състои от карбамид, натриев хлорид, дикалиев фосфат, монокалиев фосфат, екстракт от дрожди, фенол червен и дестилирана вода.

Междувременно, картенският бульон или агар на Кристенсен се състои от пептони, натриев хлорид, монокалиев фосфат, глюкоза, карбамид, фенол червен, дестилирана вода и агар-агар. Последното само ако е твърдата среда.

основа

Ензимът уреаза хидролизира уреята, като образува въглероден диоксид, вода и две молекули амоняк. Тези съединения реагират, за да образуват крайния продукт, наречен амониев карбонат.

Бульон на карбамид на Стюарт

Картофеният бульон на Stuart е по-буфериран с рН 6,8. Следователно микроорганизмът трябва да е в състояние да образува големи количества амоняк, за да стане фенол червен. PH трябва да се повиши над 8.

Следователно, карбамидният бульон на Стюарт е селективен за видовете Proteus, като дава положителни резултати в рамките на 24 до 48 часа след инкубацията и не е ефективен за бактерии, които произвеждат ниски количества уреаза или които бавно хидролизират уреята.

Това е така, защото видовете Proteus са в състояние да използват урея като източник на азот. Вместо това други бактерии, произвеждащи уреаза, се нуждаят от допълнителен източник.

Pérez et al. (2002) определя, че карбамидният бульон на Стюарт е толкова ефективен, колкото карбамидният агар на Кристенсен при определяне на уреаза в щамове на дрожди от родовете Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon и Saccharomyces.

Авторите на изследването твърдят, че са постигнали 100% съгласие с двете медии (Стюарт и Кристенсен) при инкубиране за 24 и 48 часа; с изключение на това, че щамовете, които успяха да превърнат медията в силен розово-фуксиен цвят, бяха приети като положителни.

Това уточнение е необходимо, тъй като Lodder (1970) заяви, че почти всички дрожди успяват да превърнат скосяването на карбамидния агар на Christensen в бледо розово. Това се дължи на факта, че те могат да хидролизират уреята в минимални количества и образуването на амини чрез окислително декарбоксилиране на аминокиселини на повърхността. Това не трябва да се тълкува като положително.

Арея или бульон на Кристенсен

Картофеният бульон или агар на Кристенсен е по-малко буфериран, като може да открие малки количества амоняк. Освен това тази среда е обогатена с пептони и глюкоза. Тези съединения причиняват растеж на други микроорганизми, произвеждащи уреаза, които не растат в бульон Стюарт.

По същия начин, тестът на Кристенсен карбамид предлага по-бързи резултати, особено за Proteus, като е в състояние да даде силно положителни само за 30 минути като минимално време и до 6 часа като максимално време.

Останалите микроорганизми, произвеждащи уреаза, успяват да обърнат леко цвета на средата след 6 часа и силно след 24, 48, 72 часа или повече, а дори някои щамове могат да дадат слаби реакции след 5 или 6 дни.

Тълкуване на двете медии (Стюарт и Кристенсен)

Първоначално средата е с жълто-оранжев цвят и положителната реакция ще превърне цвета на средата в розово-фуксия. Интензитетът на цвета е пряко пропорционален на количеството на произведения амоняк.

Отрицателната реакция ще остави средата от първоначалния цвят, с изключение на дрождите, които могат да станат бледо розови върху карбамидната агарова среда на Кристенсен.

подготовка

Бульон на карбамид на Стюарт

Претеглете необходимите грамове според показанията на търговската компания. Разтваря се в за предпочитане стерилна дестилирана вода. Не използвайте топлина за разтваряне, тъй като карбамидът е чувствителен към топлина.

Мембранната филтрация се използва за стерилизация. За това се използва филтър Millipore с пори с диаметър 0,45 µ. Не използвайте автоклав. След като разтворът се филтрира, той се разпределя в стерилни епруветки. За да се получат надеждни резултати, трябва да се прехвърлят между 1,5 ml като минимално количество и 3 ml като максимално количество на епруветка.

Съхранявайте в хладилник и топло преди употреба.

Ако методът на филтриране не е налице, средата трябва да се използва незабавно, за да се получат надеждни резултати.

Друг начин за приготвяне на бульона на карбамид на Стюарт е следният:

Някои търговски къщи продават основната среда за тест с карбамид, без да включват урея.

Количеството, посочено от търговското дружество, се претегля. Разтваря се в дестилирана вода и се стерилизира в автоклава при 121 ° С за 15 минути. Оставя се да почине малко и когато средата е топла, добавете 100 ml разтвор на карбамид, приготвен при 20% и стерилизиран чрез филтриране.

Разпределя се в стерилни епруветки, както е описано по-горе.

Арея или бульон на Кристенсен

-Приготвяне на разтвор на урея

Претеглят се 29 g дехидратирана урея и се разтварят в 100 ml дестилирана вода. Използвайте метода на филтриране за стерилизиране. Не автоклавирайте.

-Ахарен основен агар

Разтворете 24 g от дехидратирания основен агар в 950 ml дестилирана вода. Стерилизирайте в автоклава при 121 ° С за 15 минути. Оставете го да почине, докато достигне температура от 50 ° C и добавете предварително приготвената урея асептично.

Изсипете 4-5 ml в стерилни епруветки и наклонете до твърда маса. Трябва да има дълъг клюн на флейта.

Тази среда може да се приготви и в течна форма.

Приложения

Тестът за карбамид е изключително ефективен за разграничаване на род Proteus от други родове от семейството Enterobacteriaceae, предвид бързата реакция, осигурена от Proteus.

Използвайки състава на Кристенсен, тестът помага да се направи разлика между видове от един и същи род. Например, S. haemolyticus и S. warneri са коагулазно-отрицателен и бета-хемолитичен стафилокок, но се различават по това, че S. haemolyticus е урея отрицателен, а S. warneri - урея-позитивен.

От друга страна, McNulty успешно използва 2-процентен карбамиден бульон на Christensen, за да проучи наличието на Helicobacter pylori в биопсични проби, взети от стомашната лигавица (антрална област).

Наличието на H. pylori се доказва от положителен тест за карбамид. Продължителността на времето за наблюдение на резултатите е пряко пропорционална на количеството присъстващи микроорганизми.

Както се вижда, това е прост метод за диагностициране на Helicobacter pylori при стомашни биопсии.

И накрая, този тест е полезен и за разграничаване на видовете от родовете Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus и Mycobacteria.

Засяване на теста за карбамид

И двата метода изискват силен микробен инокулум за оптимизиране на резултатите. За предпочитане е бактериалните колонии да се вземат от кръвен агар, а дрождите от Sabouraud агар, с няколко изключения. Инокулумът се емулгира в течната среда.

За карбамидния бульон на Stuart инкубирайте при 37 ° C за 24 до 48 часа, като знаете, че търсите щамове Proteus само когато щамът е бактерия. За дрождите може да се инкубира при 37 ° С или при стайна температура в продължение на 24 до 48 часа инкубация.

В случая с карбамидов бульон на Кристенсен, той се инкубира при 37 ° С за 24 часа. Ако тестът е отрицателен, той може да се инкубира до 6 дни. Ако тестът е положителен преди 6 часа, това показва, че е щам от рода Proteus.

В случая с карбамиден агар на Кристенсен агарът на агара е силно инокулиран, без пробиване. Бульонът се инкубира и интерпретира по същия начин.

QA

Контролни щамове като Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 и Salmonella typhimurium могат да бъдат използвани за тестване на средата. Първите два трябва да дадат положителни резултати, а последните два отрицателни.

Източник: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологична диагноза. 5-то изд. Редакция Panamericana SA Аржентина.

Препратки

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Използване на карбамидния бульон на Stuart за теста за уреаза, като тест при диагностицирането на дрожди. Преподобни Вен. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Достъпно на: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Биохимични тестове за идентифициране на бактерии с клинично значение. 3-то изд. Редакция Panamericana. Буенос Айрес. Аржентина.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Микробиологична диагностика на Бейли и Скот. 12 изд. Редакция Panamericana SA Аржентина.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологична диагноза. 5-то изд. Редакция Panamericana SA Аржентина.
5. Britannia Laboratories. Christensen Medium (основа на агарен карбамид) 2015 г. Наличен на адрес: britanialab.com