РЕСТРИКЦИОННИ ЕНЗИМИ: ФУНКЦИИ, ВИДОВЕ И ПРИМЕРИ - БИОЛОГИЯ - 2025

На ензимите на рестрикция са ендонуклеази, използвани от някои археи и бактерии за инхибиране или "ограничи" разпространението на вируси вътре. Те са особено разпространени при бактериите и са част от защитната им система срещу чужда ДНК, известна като рестрикционна / модификационна система.

Тези ензими катализират разцепването на двулентовата ДНК на определени места, възпроизводимо и без използване на допълнителна енергия. Повечето изискват присъствието на кофактори като магнезий или други двувалентни катиони, въпреки че някои също изискват ATP или S-аденозил метионин.

Реакционна схема на рестрикционен ензим HindIII (Източник: Helixitta чрез Wikimedia Commons)

Рестрикционните ендонуклеази са открити през 1978 г. от Даниел Натанс, Арбър Вернер и Хамилтън Смит, които получиха Нобеловата награда за медицина за своето откритие. Името им обикновено произлиза от организма, където са наблюдавани за първи път.

Такива ензими са широко използвани при разработването на методи за клониране на ДНК и други молекулярни биологични и генно-инженерни стратегии. Техните специфични характеристики за разпознаване на последователност и способността да се режат последователности близо до местата за разпознаване ги превръщат в мощни инструменти в генетичните експерименти.

Фрагменти, генерирани от рестрикционни ензими, които са действали върху определена молекула на ДНК, могат да бъдат използвани за пресъздаване на "карта" на първоначалната молекула, като се използва информация за местата, където ензимът отрязва ДНК.

Някои рестрикционни ензими могат да имат едно и също място на разпознаване на ДНК, но не е задължително да го режат по същия начин. По този начин има ензими, които режат оставящи тъпи краища, и ензими, които отрязват напускащите се кохезивни краища, които имат различни приложения в молекулярната биология.

В момента има стотици различни търговски достъпни рестрикционни ензими, предлагани от различни търговски къщи; Тези ензими функционират като "потребителски" молекулярни ножици за различни цели.

Характеристика

Рестрикционните ензими изпълняват обратната функция на полимеразите, тъй като те хидролизират или разрушават естерната връзка във фосфодиестерната връзка между съседни нуклеотиди в нуклеотидна верига.

В молекулярната биология и генното инженерство те са широко използвани инструменти за изграждане на експресионни и клониращи вектори, както и за идентифициране на специфични последователности. Те са полезни и за изграждането на рекомбинантни геноми и имат голям биотехнологичен потенциал.

Неотдавнашният напредък на генната терапия използва настоящите ензими на рестрикцията за въвеждането на определени гени във вектори, които са носители за транспортирането на такива гени в живи клетки и които вероятно имат способността да се вмъкват в клетъчния геном за извършване постоянни промени.

Механизъм на действие

Рестрикционните ензими могат да катализират двучестотно разцепване на ДНК, въпреки че някои са способни да разпознават еднолентови ДНК последователности и дори РНК. Разрязването става след разпознаване на последователностите.

Механизмът на действие се състои в хидролизата на фосфодиестерната връзка между фосфатна група и дезоксирибоза в скелета на всяка верига от ДНК. Много от ензимите са способни да се режат на едно и също място, което разпознават, докато други отрязват между 5 и 9 базови двойки преди или след него.

Обикновено тези ензими се нарязват в 5 'края на фосфатната група, като се получават ДНК фрагменти с 5' фосфорилен край и 3 'краен хидроксилен край.

Тъй като протеините не влизат в директен контакт с разпознаваемия сайт в ДНК, те трябва да бъдат преместени последователно, докато се постигне специфичният сайт, може би чрез „плъзгащи“ механизми върху нишката на ДНК.

По време на ензимно разцепване, фосфодиестерната връзка на всяка от ДНК веригите е разположена в един от активните места на рестрикционните ензими. Когато ензимът напусне мястото на разпознаване и разцепване, той прави това чрез неспецифични преходни асоциации.

Видове

Понастоящем са известни пет вида рестрикционни ензими. Ето кратко описание на всеки от тях:

Рестрикционни ензими тип I

Тези ензими са големи пентамерни протеини с три субединици, една за рестрикция, една за метилиране и една за разпознаване на последователността в ДНК. Тези ендонуклеази са многофункционални протеини, способни да катализират рестрикционни и модификационни реакции, имат активност на АТФаза и също така ДНК топоизомераза.

Ензимите от този тип бяха първите открити ендонуклеази, те бяха пречистени през 60-те години на миналия век и оттогава са проучени в голяма дълбочина.

Ензимите от тип I не се използват широко като биотехнологичен инструмент, тъй като мястото на разцепване може да бъде на променливо разстояние до 1000 базови двойки от мястото на разпознаване, което ги прави ненадеждни по отношение на експериментална възпроизводимост.

Резистентни ензими тип II

Те са ензими, съставени от хомодимери или тетрамери, които отрязват ДНК на определени места с дължина между 4 и 8 bp. Тези места на разцепване обикновено са палиндромни, т.е. те разпознават последователности, които се четат по един и същ начин и в двете посоки.

Много от рестрикционните ензими тип II отрязват ДНК, когато разпознаят чуждия му характер, тъй като той няма типичните модификации, които собствената му ДНК трябва да има.

Това са най-простите рестрикционни ензими, тъй като те не изискват никакъв кофактор, освен магнезий (Mg +), за да разпознаят и разрежат последователностите на ДНК.

Прецизността на рестрикционните ензими тип II при разпознаване и рязане на прости секвенции в ДНК в точни позиции ги прави едни от най-широко използваните и незаменими в повечето клонове на молекулярната биология.

В рамките на рестрикционните ензими от тип II има множество подкласове, класифицирани според определени свойства, които са уникални за всеки един от тях. Класификацията на тези ензими се извършва чрез добавяне на букви от азбуката, от A до Z след името на ензима.

Някои от подкласовете, най-известни със своята полезност са:

Подклас IIA

Те са димери на различни подединици. Те разпознават асиметрични последователности и се използват като идеални предшественици за генерирането на режещи ензими.

Подклас IIB

Те са съставени от един или повече димери и отрязват ДНК от двете страни на разпознаваемата последователност. Те отрязват и двете нишки на ДНК базов интервал преди двойката на разпознаване.

Подклас IIC

Ензимите от този тип са полипептиди с функции на разделяне и модифициране на ДНК вериги. Тези ензими отрязват и двете нишки асиметрично.

Подклас IIE

Ензимите от този подклас са най-използваните в генното инженерство. Те имат каталитичен сайт и обикновено изискват алостеричен ефектор. Тези ензими трябва да взаимодействат с две копия на тяхната последователност за разпознаване, за да извършат ефективно разцепване. В рамките на този подклас са ензимите EcoRII и EcoRI.

Рестрикционни ензими тип III

Ендонуклеазите от рестрикционен тип III са съставени само от две субединици, едната е отговорна за разпознаването и модифицирането на ДНК, докато другата е отговорна за разделянето на последователността.

Тези ензими изискват два кофактора за своята функция: ATP и магнезий. Рестрикционните ензими от този тип притежават две асиметрични места за разпознаване, преместват ДНК по ATP-зависим начин и я разрязват между 20-30 bp в съседство с разпознаващото място.

Резистентни ензими тип IV

Ензимите от тип IV са лесни за идентифициране, тъй като те разрязват ДНК с метилиращи белези, те са съставени от няколко различни субединици, които са отговорни за разпознаването и разрязването на ДНК последователността. Тези ензими използват GTP и двувалентния магнезий като кофактори.

Специфичните места на разцепване включват нуклеотидни нишки с метилирани или хидроксиметилирани цитозинови остатъци върху една или и двете нишки на нуклеиновите киселини.

Рестрикционни ензими тип V

Тази класификация групира ензимите CRISPER-Cas, които идентифицират и отрязват специфични последователности на ДНК от нахлуващи организми. Cas ензимите използват верига от CRISPER синтезирана водача РНК, за да разпознаят и атакуват нашественици организми.

Ензимите, класифицирани като тип V, са полипептиди, структурирани от ензими тип I, II и II. Те могат да изрязват участъци от ДНК на почти всеки организъм и с широк диапазон на дължина. Тяхната гъвкавост и лекота на използване правят тези ензими един от най-широко използваните инструменти в генното инженерство днес, заедно с ензимите тип II.

Примери

Рестрикционните ензими са използвани за откриване на ДНК полиморфизми, особено в популационните генетични изследвания и еволюционните изследвания, използващи митохондриална ДНК, за да се получи информация за скоростта на нуклеотидните замествания.

Понастоящем векторите, използвани за трансформация на бактерии за различни цели, притежават мултиклониращи сайтове, където са открити места за разпознаване на множество рестрикционни ензими.

Сред тези ензими най-популярни са EcoRI, II, III, IV и V, получени и описани за първи път от E. coli; HindIII от H. influenzae и BamHI от B. amyloliquefaciens.

Препратки

1. Bickle, TA, & Kruger, DH (1993). Биология на ограничаване на ДНК. Микробиологични рецензии, 57 (2), 434–450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA, & Horvath, P. (2007). CRISPR осигурява придобити устойчивост срещу вируси в прокариоти. Science, 315 (март), 1709–1713.
3. Goodsell, D. (2002). Молекулярната перспектива: ограничаващи ендонуклеази. Основи на стволовите клетки на раковата медицина, 20, 190–191.
4. Halford, SE (2001). Скачане, скачане и циклиране чрез рестрикционни ензими. Биохимично общество транзакции, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003). Поддържане на идентичността на видовете и контролиране на видовете бактерии: нова функция за системите за ограничаване / модификация? Ген, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Гени на Lewin XII (12 изд.). Бърлингтън, Масачузетс: Джоунс и Бартлет Обучение.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N.,… She, Q. (2015). Използвайте CRISPR-Cas системи тип I и тип III за редактиране на геноми. Изследване на нуклеинови киселини, 1–12.
8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). Рестрикционни ензими тип I и техните роднини. Изследване на нуклеиновите киселини, 1–25.
9. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Рестрикция Ендонуклеази в анализа и преструктурирането на молекулите на ДНК. Annu. Преподобна Биохим., 273–293.
10. Nei, M., & Tajima, F. (1981). ДНК полиморфизъм, откриваем чрез рестрикционни ендонуклеази. Генетика, 145-163.
11. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Ендонуклеази за ограничаване на клетъчния и молекулярния живот Тип II: ендонуклеази: структура и механизъм Науки за клетъчния и молекулярния живот на CMLS, 62, 685–707.
12. Робъртс, Р. (2005). Как рестрикционните ензими станаха работните коня на молекулярната биология. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
13. Roberts, RJ, & Murray, K. (1976). Ограничаване ендонуклеази. Критични рецензии в биохимията, (ноември), 123-164.
14. Stoddard, BL (2005). Структура и функция на ендонуклеазата на домашния хоризонт. Тримесечни рецензии на биофизика, 1–47.
15. Tock, MR, & Dryden, DTF (2005). Биологията на ограничението и антирестрикцията. Текущо становище по микробиология, 8, 466–472.
16. Wilson, GG, & Murray, NE (1991). Ограничителни и модификационни системи. Annu. Преподобни Генети., 25, 585-627.
17. Wu, Z., & Mou, K. (2016). Геномни прозрения за Campylobacter jejuni вирулентност и популационна генетика. Infec. Dis. Transl. Мед., 2 (3), 109–119.
18. Yuan, R. (1981). Структура и механизъм на многофункционалните рестрикционни ендонуклеази. Annu. Преподобна Биохим., 50, 285-315.